FONAIAP   DIVULGA  No.  38                                                                                                            Octubre-Diciembre    1991

El Servicio de Diagnóstico de Rabia del Instituto de Investigaciones Veterinarias

 Noris Plaza Morales, Sara Papo Valkelic, Magaly S. de Zambrano.

Investigadores FONAIAP CENIAP. IIV

Uno de los servicios de sanidad animal que brinda el Instituto de Investigaciones Veterinarias del CENIAP, es el de Diagnóstico de Rabia en animales enfermos o sospechosos de sufrir la enfermedad. Adicionalmente, se realiza de manera rutinaria, el control de calidad de vacunas antirrábicas antes de su distribución para uso veterinario. En este artículo se reseñan las actividades y técnicas que se utilizan para la eficiente presentación de este servicio a los productores 

DIAGNOSTICO   DE   RABIA 

    Todo animal sospechoso de padecer la rabia debe ser capturado y mantenido en observación durante diez días, si es posible, dejando que la enfermedad evolucione hasta la muerte, ya que un sacrificio prematuro de estos animales disminuiría la precisión del diagnóstico, pues los corpúsculos de Negri se desarrollan en el tejido cerebral en relación directa con la duración del proceso clínico de la enfermedad. 

a. Envió de muestras al laboratorio 

    La muestra necesaria para el diagnóstico de rabia es el cerebro del animal y la forma de enviarla al laboratorio dependerá de la distancia que haya entre el sitio donde se tome y el laboratorio donde será diagnosticada. 

    La cabeza del animal (muestra) se podrá enviar dentro de una bolsa plástica resistente y rellena con hielo húmedo, la cual a su vez, es colocada en una cava de anime cubierta de hielo. Luego, debe ser herméticamente cerrada. Igualmente, la muestra se podrá enviar en hielo seco o los trozos de cerebro en un recipiente con solución de glicerina al 50%, lo cual no necesita refrigeración. 

b. Técnicas de diagnóstico 

b.1. Directa de anticuerpos fluorescentes: se realizan impresiones en láminas portaobjetos en diferentes secciones del tejido cerebral (asta de Amón, corteza, cerebelo) y se fijan en acetona a -20°C por 20 minutos y luego se procede a la coloración demarcando primero el frotis. Posteriormente, se coloca en las diferentes impresiones una gota de una dilución de conjugado más suspensión de cerebro normal de ratón y en otras, conjugado más suspensión de cerebro de ratón infectado con virus rábico. Estas impresiones se incuban a 37°C por 30 minutos, luego se sumergen en solución buffer por diez minutos y se lavan después con agua destilada. Se dejan secar, se coloca un cubre objeto y se observan a través del microscopio de inmunofluorescencia, donde, en caso de haber virus rábico en la muestra analizada, se observarán inclusiones de diferentes formas y tamaño de color verde manzana fluorescente sobre un campo oscuro. 

b.2. Inoculación de ratones: en todos los casos que resulte una muestra negativa por inmunofluorescencia, es imprescindible practicar la inoculación en animales de laboratorio para el aislamiento del virus. 

    Para realizar esta técnica se prepara una suspensión al 10% de material cerebral sospechoso (pool de asta de Amón, cerebelo y corteza, de 2 a 3 g) utilizando como diluyente suero normal de equino al 2% más una solución de antibiótico. Se inocula 0,01 ml de suspensión preparada en ratones lactantes por vía intracraneal (2 camadas de 8 ratones c/u) y se observan diariamente por 21 días. A partir del quinto día de inoculados se puede sacrificar un ratón para detectar el antígeno de la rabia por el método de anticuerpos fluorescentes o en caso que se les observe síntomas de la enfermedad. 

CONTROL DE CALIDAD DE VACUNAS ANTIRRÁBICAS 

    En el Laboratorio de Rabia del Instituto de Investigaciones veterinarias, se realiza el control de calidad oficial a tas vacunas antirrábicas, antes de su distribución para el uso veterinario, siguiendo las normas internacionales vigentes establecidas por la organización Mundial de la Salud. 

    Dado que existen dos tipos de vacunas antirrábicas (inactivada y a virus vivo modificado) se han establecido pruebas normalizadas que son comunes o diferentes para cada caso. Estas se mencionan a continuación:

 1. Esterilidad 

   Determina la presencia de bacterias u hongo que producen la contaminación del producto. Se efectúa mediante la siembra de cierto volumen de la vacuna problema en diferentes medios de cultivo (caldo simple, agar, sabouraud y tioglicolato), los cuales se incuban a. 37"C y se observan por 14 días. No debe ocurrir ningún crecimiento microbiológico.

 2. Toxicidad 

   Detecta cualquier sustancia tóxica que pueda causar lesiones en los tejidos, a nivel del sitio de la inyección del producto. Diez ratones adultos son inmunizados por vía intramuscular con 0,5 ml de la vacuna problema y se observan por 14 días con el objeto de apreciar si aparecen lesiones en el sitio de inoculación. No debe ocurrir ninguna reacción. Las pruebas de esterilidad y toxicidad son comunes a todos los tipos de vacuna antirrábica. 

 3. Inocuidad 

   Determina la presencia de virus rábico residual en las vacunas inactivadas. Consiste en inocular 0,01 ml de vacuna por vía intracerebral a ratones lactantes y se observan por 21 días. No debe ocurrir ningún signo clínico de la enfermedad en los animales inoculados. 

 4. Título infeccioso o viabilidad 

   Detecta la cantidad de virus rábico residual en vacunas a virus vivo modificado, necesaria para inducir la formación de anticuerpos sin generar la enfermedad. 

   Se realizan diluciones decuples  seriadas de la vacuna que se inoculan en ratones de 21 días por vía intracerebral a razón de 0,03 ml, observándose durante 21 días. El título mínimo estimado de esta prueba es 10^3-0DL50/O'03 ml, obtenido por el cálculo de ReedMuench. 

 5. Potencia 

    Mide la capacidad de la vacuna para inducir anticuerpos antirrábicos en el receptor. Se utilizan dos pruebas diferentes: 

NHI: determina la capacidad inmunogénica de las  vacunas antirrábicas inactivadas para proteger contra la rabia. Consiste en efectuar diluciones quíntuples seriadas de la vacuna que se utiliza para inmunizar ratones de 21 días, por vía intraperitoneal con 0,5 ml, repitiéndose este proceso siete días después. A los 14 días de la primera vacunación se desafían los ratones inmunizados con una dilución de virus fijo que contenga 40 DL50, 0,03 ml  por vía intracerebral y se observan por 15 días. La prueba es satisfactoria cuando se obtiene un valor igualo superior a 0,3 UI/ml. 

Método Koprowski: 

     Determina la potencia de las vacunas a virus vivo modificado. Son inmunizados diez cobayos de 350 g de peso, en la pata derecha, por vía intramuscular con 0,25 ml de la vacuna problema. A los 21 días después de la vacunación, los cobayos vacunados y el mismo número de testigos, se desafían con 500 DL50 de virus fijo o de vampiro, en la pata izquierda, por vía intramuscular con 0,25 mi de la dilución de virus desafío y se observan por 21 días. El resultado es satisfactorio cuando el 70% de los cobayos vacunados sobrevive y el 80% de los testigos muere. 

Las vacunas antirrábicas deben obtener resultados satisfactorios en todas las pruebas de control de calidad para ser liberadas al mercado v. en consecuencia, utilizadas en la profilaxis de los animales  contra la rabia.