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Caña de Azúcar, Vol. 15(2):69-75. 1997. DETECCIÓN DE Ustilago scitaminea Sydow POR TÉCNICAS HISTOLÓGICAS E INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA EN YEMAS DE CAÑA DE AZÚCAR Mercedes Capote1, Ana M. Pérez2, Acevedo, R.1 y Dolores Piñón1 1Instituto
Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar. |
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RESUMEN Se utilizaron yemas de las variedades de caña de azúcar Co 213 (altamente susceptible) y M y 5514 (altamente resistente) al carbón Ustilago Scitaminea. Los muestreos se realizaron a las 6. 12, 24, 48 y 72 horas de post-inoculación. Se evaluó la eficiencia de diferentes tratamientos de la yema con sustancias antioxidantes, así como distintos colorantes. Para la inmunofluorescencia indirecta (IIF) se siguió la técnica de Acevedo y Piñón. Los mejores resultados se obtuvieron tratando los tejidos con ácido cítrico como antioxidante y realizando las tinciones con azul de anilina al 0,01%. La visualización de las hifas se logró a partir de las 48h de post-inoculación, aunque la mayor concentración se observó a las 72h, coincidiendo estos resultados con los obtenidos por IIF. Estos estudios permiten valorar la utilidad de esas técnicas tanto para el diagnóstico de la enfermedad como para el desarrollo de estudios fisiopatológicos. Palabras clave: Ustilago scitaminea, caña de azúcar, inmunofluorescencia, antioxidantes, diagnóstico de laboratorio, Cuba. DETECTION OF Ustilago Scitaminea Sydow, BY HISTOLOGICAL TECHNICS AND ABSTRACT Buds from Co 213 (highly susceptible) and My 5514 (highly resistant) varieties to the sugarcane smut were used. The samples were carried out at 6, 12, 24, 48 and 72 hours after post-inoculation. The efficiency of different buds treatments with antioxidant substances. were evaluated, as well several coloring. The indirect inmunefluorescence (IIF) was accomplished following Acevedo and Piñón's technics; the best results were obtained using citric acid as antioxidant for tissues and blue of aniline at 0.01% for tinge. After 48 hours of post-inoculation the hypha was visible, altough the highest concentration was observed at 72 hours, these results are similar to obtained for IIF. These studies allow to assess the usefulness of these technics both for disease's diagnosis and to develop physiopathological studies. Key words: Ustilago scitaminea, sugar cane, inmunefluore- scence, antioxidants, laboratory tests. INTRODUCCIÓN Dada la importancia de la enfermedad del carbón de la caña de azúcar causada por Ustilago scitaminea Sydow, resulta de gran interés el desarrollo de técnicas que permitan la detección de este hongo en los tejidos de la caña de azúcar, para su posible utilización en el diagnóstico de esta enfermedad, así como para facilitar los estudios de la biología "in vivo" de este microorganismo y de sus mecanismos de resistencia. El objetivo de este trabajo ha sido la estandarización de técnicas histológicas para la detección de hifas de U. scitaminea en tejidos meristemáticos de caña de azúcar, y corroborar estos resultados con los obtenidos al utilizar técnicas más sensibles como la Inmunofluorescencia indirecta (IIF). MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron yemas de las variedades Co 213 (altamente susceptible) y M y 5514 (altamente resistente), las cuale, s fueron lavadas y tratadas previamente a 52° C durante 20 minutos (4) y colocadas en bandejas, sobre un lecho húmedo. Posteriormente las yemas fueron inoculadas con una pasta de teliosporas del hongo, manteniendo yemas como controles sanos (no inoculadas). Los muestreos se realizaron a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas de post-inoculación. Para lograr los cortes histológicos se utilizó un micrótomo de congelación y se evaluó previamente la eficiencia de diferentes anti-oxidantes: ácido-cítrico, dietilditiocarbamato de sodio e hipoclorito de sodio. Se probaron diferentes tinciones: azultrypan-lactofenol, reportada por Morton (9) modificada por Sinha et al. (7); hematoxilina de Harris (2) y azul de anilina al 0, 1% (6). Las preparaciones se montaron con Bálsamo de Canadá y se observaron a través de un microscopio Olympus BH-2 con objetivos x40 y x100. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con 5 repeticiones y se realizaron 10 observaciones por cada yema. Para la IIF se maceraron las yemas en buffer PBS pH 7,4 y se siguió la técnica de Acevedo y Pinón (1). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los mejores resultados se obtuvieron con el empleo del ácido cítrico como antioxidante, garantizándose una mayor conservación del tejido para el montaje de las preparaciones histológicas y realizando la tinción con azul de anilina al 0,1%. La visualización de las hifas de U. scitaminea se logró a partir de las 48 h de post-inoculación en la variedad susceptible, aunque la mayor concentración se observó a las 72 horas (Fig. 1), en la variedad resistente no fue posible la observación de las estructuras fungosas, coincidiendo estos resultados con los reportados por Pérez y Mauri (4). Los resultados obtenidos al utilizar las técnicas histológicas fueron corroborados por IIF, mediante la cual las hifas pudieron ser detectadas a partir de las 6 horas de post-inoculación ya que esta técnica tiene una mayor sensibilidad (Fig. 2). Sin embargo sólo a las 72 horas se pudieron observar altas concentraciones de hifas.
CONCLUSIONES La utilización del ácido cítrico como antioxidante y la tinción de azul de anilina al 0,1% resultaron las mejores variantes para la detección de las hifas del U. scitaminea en los tejidos meristemáticos de yemas de caña de azúcar mediante técnicas histológicas. Los resultados obtenidos permiten valorar la utilidad de las técnicas histológicas y de inmunofluorescencia indirecta tanto para el diagnóstico de la enfermedad como para el desarrollo de estudios fisiopatológicos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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