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Veterinaria Tropical 11:
43-46. 1986
DIAGNOSTICO DE LA GASTROENTERITIS TRANSMISIBLE DEL CERDO EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA USANDO INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA M. de Rolo*, C. Mar�n*, S. de S�fontes*, H. Casta�os*, L. de Alv�rez* y N. de L�pez* *FONAIAP. Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias. |
RESUMEN Secciones de intestino delgado (yeyuno e ile�n) fueron recolectadas en necropsias de cerdos con sospecha de gastroenteritis transmisible (TGE). Un segmento de cada muestra fue fijado en formol al 10%, incluido posteriormente en parafina y luego cortado a 4�; la otra parte fue congelada inmediatamente de su recolecci�n en la necropsia, a -20�C, para ser cortada luego a 4� de espesor. Ambos segmentos fue ron te�idos con suero antivirus de TGE del cerdo, conjugado con fluoresceina, para detectar los ant�genos virales presentes en las c�lulas epiteliales de la vellosidad atrofiada. De un total de 59 muestras procesadas de intestino de cerdos, 15 resultaron positivas tanto en el material fijado en formol e incluido en parafina, como en el material congelado. La t�cnica result� eficiente y tan sensible como la del procesamiento de las muestras congeladas, por tal raz�n este m�todo puede ser utilizado para diagnosticar TGE cuando s�lo se dispone de materiales fijados en formol. INTRODUCCI�N La t�cnica de inmunofluorescencia directa (IFD) ha sido ampliamente usada para la localizaci�n de ant�genos virales en secciones congeladas de intestino delgado de suinos (3) y en cultivos celulares; sin embargo, la misma tiene la limitaci�n de que se necesitan tejidos frescos para su procesamiento. Sternberg (5) describi� el m�todo de peroxidasa antiperoxidasa (PAP), en la cual la coloraci�n con inmunoperoxidasa puede realizarse en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Por su parte Holscher (2) utiliz� inmunoperoxidasa para el diagn�stico de enteritis viral en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. En este trabajo se describe la aplicaci�n del m�todo de inmunofluorescencia directa (IFD) aplicada al diagn�stico de gastroenteritis transmisible (TGE) en cerdos a partir de muestras de tejidos incluidas en parafina, compar�ndolo con el resultado obtenido usando muestras congeladas. MATERIALES Y M�TODOS Las muestras utilizadas proven�an de animales con procesos ent�ricos sospechosos de la enfermedad, la cual ya ha sido reportada en el pa�s (4). Fragmentos de intestino delgado (yeyuno e ile�n) fueron fijados en formol al 10% y posteriormente incluidos en parafina; luego se cortaron en microtomo de deslizamiento, marca Forma Scientific, en secciones de 4� de espesor y colocadas en l�minas portaobjetos, para someterlas a un proceso de desparafinaci�n con cuatro cambios de xilol, de 10 minutos cada uno, y de dos pases en etanol absoluto para clarificar; luego se sometieron a tres pases en bufer-fosfato-salino (PBS) pH 7,2. Otro segmento de intestino fresco fue congelado inmediatamente despu�s de su recolecci�n y cortado en criostato, marca Shandon, en secciones de 4�, y fijadas en acetona a -20�C. Ambos tipos de muestras fueron coloreadas con suero antivirus de TGE conjugado con isotiocianato de fluoresceina (Donado por el Dr. Charles Kanitz, Purdue University, Indiana-EE.UU); luego se lavaron tres veces con PBS ph 7,2 para eliminar el exceso de colorante. Las laminillas se montaron con una mezcla de PBS: glicerol (1:9), realiz�ndose la lectura de las l�minas, en la mayor�a de los casos, inmediatamente despu�s de su preparaci�n; cuando no se pudo proceder de esta manera, las l�minas se guardaron en refrigeraci�n a 4�C hasta el momento de la lectura. La interpretaci�n diagn�stica del preparado se realiz� en microscopio de luz marca Leitz Dialux 20 EB, usando objetivo 40 x. RESULTADOS Todas las muestras fueron sometidas a ambos procesos, es decir, procesamiento de cortes de material congelado y cortes en material incluido en parafina. En 15 de las muestras procesadas se detectaron ant�genos virales en las c�lulas epiteliales de la velocidad atrofiada. Los resultados obtenidos por los dos m�todos fueron similares en todas las muestras procesadas, raz�n por la cual se establece que el m�todo de procesamiento de muestras incluidas en parafina puede ser utilizado para el diagn�stico espec�fico de la enfermedad mediante la IFD. En el caso de las muestras positivas, el "background" o fondo fue un poco mayor en los cortes en parafina que en los cortes de material congelado, sin embargo, se pudo reconocer muy bien la positividad de una muestra con respecto a otra. DISCUSI�N El m�todo de inmunofluorescencia directa es una t�cnica muy sensible y espec�fica para la identificaci�n de ant�genos virales en tejidos y ha sido ampliamente usada para el diagn�stico de diversas entidades patol�gicas. Hasta el presente, las rese�as del uso de este m�todo indican que se emplea utilizando cortes de criostato de segmentos de intestino. En este trabajo se propone esta metodolog�a para el diagn�stico r�pido y espec�fico de esta entidad patol�gica en cortes de tejidos fijados en formol al 10% e incluidos en parafina. Holscher, et al. (2) informan sobre el uso de tejidos incluidos en parafina para el diagn�stico de enteritis viral en suinos, utilizando la t�cnica de inmunoperoxidasa, resultando el m�todo muy eficiente. Tambi�n se ha utilizado la t�cnica del complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa para demostrar la presencia del virus Sendai, en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (1). Otro reporte del uso de materiales incluidos en parafina es el presentado por Bundza et al., en 1986 quienes evidenciaron ant�geno del virus de la peste de peque�os rumiantes en ovinos afectados por la enfermedad; en este caso se utiliz� la t�cnica de inmunoperoxidasa directa. Los ant�genos proteicos no son desnaturalizados como consecuencia de fijaci�n en formol, deshidrataci�n e inclusi�n en parafina, como se puede evidenciar en los trabajos anteriormente citados (1,2), por lo cual puede recomendarse la utilizaci�n de este tipo de materiales para realizar de IFD en el diagn�stico de TGE y otras entidades patol�gicas. Un aspecto importante a tener en cuenta en el procesamiento de los materiales, es el obtener una buena desparafinaci�n, lo cual redundar�a en la eliminaci�n de la interferencia de los restos de parafina en el conjugado y por ende en la puesta en evidencia neta de la reacci�n fluorescente, cuando se trata de casos positivos. SUMMARY Section of small intestine (jejunum and ileum) were collected at necropsy from suspected transmissible gastroenteritis (TGE) virus infected pigs. From each sample one section was fixed in 10% formalin, embedded in paraffin, and sectioned at 4�; the another section was frozen at -20�C in the moment of recolection at necropsy and sectioned at 4�. Both sections were stained with FITC conjugate anti-TGE serum for detection of viral antigens in epithelial cells of atrophied villi.ln this paperwere procesed 59 samples of small intestine of swine, of wich 15 were positive from the sample fixed in formalin as well as from the frozen sample. The technique was found to be as sensitive and efficient as the technique of the frozen sample. This method may be utilizing by diagnosis to TGE when only formalin fixed specimens are available. BIBLIOGRAF�A 1. HALL.C. H.;WARD.J. M. 1984. Acomparison of the Avidin-Biotin-Peroxidase (PAP) inmuno cytochemical techniques for demostrating sendai virus infection in fixed tissue specimens. Lab. An. Sci. 34 (3): 261-263. 2. HOLSCHER. M. A.; KASSELBERG, A. G.; POWELL, H. S.; WILSON. R.B. 1984. Formalin fixed paraffin embedded tissue. Am. Assn. Veterinary Laboratory Diagnosticians. 27 Annual. Proceedings (EE.UU.). p. 51-58. 3. KONISCHI. S.; BOUKOWSKI, R. A. 1967. Use of fluorescein-labeled antibody of rapid diagnosis of transmissible gastroenteritis in experimentally infected pigs. Am. J. Vet. Res. (EE.UU.). 28: 937-942. 4. MARIN, C.; ROLO de M., LOPEZ. N.; ALVAREZ, L.; CASTA�OS. H.; SIFONTES, S. 1985. Detecci�n de focos de gastroenteritis transmisible en Venezuela. Veterinaria Tropical (Ven.). 10: 35-42. 5. STERBERGER, L. A. 1979. Inmunocyto chemistry. 2ed. New York, EE.UU. Yohn Willey Sons. |