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Veterinaria Tropical 11:
9-29. 1986
INCIDENCIA DE DETERMINANTES GEN�TICOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS EN CEPAS DE Escherichia coli, AISLADAS EN CASOS DE DIARREA EN SUINOS DE LA REGI�N CENTRAL DE VENEZUELA Y. Pineda de Mora* y V.
Rodr�guez Lemolne**
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RESUMEN El an�lisis de los determinantes de resistencia a los agentes antimicrobianos en cepas de Escherichia coli, aisladas en lechones con s�ndrome de diarrea aguda, permiti� demostrar que en la poblaci�n porcina examinada, proveniente de 27 granjas en la regi�n central del pa�s (estados Aragua, Carabobo y Miranda), la multiresistencia era debida fundamentalmente a la presencia de pl�smidos transmisibles pertenecientes a los grupos de incompatibilidad identificados como FV (85%), FIV (8,57%) y FI (5,7%). Las cepas aisladas fueron resistentes a estreptomicina. SM (100%); tetraciclina, Tc (100%); triple sulfa,Ts (100%); ampicilina, Am (75,4%); nitrofurantoin, Nf (65,5%); kanamicina, Km (59%); neomicina, Nm (55,7%); trimetropin-sulfametoxazole, Tsx (55, 7%) ; cloranfenicol, Cn (52,4%) ; cefalotin, Cf (37,7) ; colistin, CI (19,6%); gentamicina, Gm (3%) y polimixin B, PB (1,6%). Se observ� un patr�n b�sico de multiresistencia, altamente estable, constituido por Am-Sm-Ts ligado a pl�smidos transmisibles. La alta frecuencia de multiresistencia revela la existencia de fuertes presiones selectivas ejercidas por el uso indiscriminado de los agentes antimicrobianos en la cr�a porcina en Venezuela. INTRODUCCI�N La diarrea en cerdos durante las primeras semanas de vida, es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en la poblaci�n porcina mundial, especialmente en pa�ses en v�as de desarrollo (6). La diarrea es un proceso complejo donde interact�an diversos agentes infecciosos, el medio ambiente, condiciones nutricionales y de manejo (1 ). Escherichia coli enteropat�gena ha sido el agente infeccioso m�s ampliamente incriminado como una de las causas determinantes de la diarrea neonatal (14, 17, 18). Las p�rdidas econ�micas causadas en Venezuela por esta afecci�n no han sido adecuadamente analizadas, aunque ha sido reconocida como una de las afecciones que acarrea mayores p�rdidas econ�micas, representando un duro golpe a la tercera industria pecuaria nacional. El tratamiento m�s com�nmente utilizado para el control de este proceso infeccioso es la terapia antimicrobiana, cuya efectividad se ha visto reducida por la aparici�n de cepas bacterianas resistentes a los antimicrobianos de uso m�s com�n en la pr�ctica veterinaria. Esto es una consecuencia de su empleo intensivo en la cr�a porcina, como agentes promotores del desarrollo, preventivos de enfermedades y terap�uticos (3, 9, 15, 19, 27, 28, 29). En Venezuela no se ha establecido una normativa que regule el tipo y concentraci�n de los antimicrobianos que podr�an adicionarse a los alimentos para uso animal (comunicaci�n personal Ministerio de Agricultura y Cr�a). Esto se ve agravado por la falta de informaci�n sistematizada de la multiresistencia bacteriana a los anti-microbianos en nuestro medio. Este estudio preliminar se realiz� con el objeto de conocer la incidencia de la resistencia, la transmisibilidad de estos determinantes de resistencia y la epidemiolog�a de los pl�smidos de resistencia (R) en cepas de E. coli, aisladas en casos de diarrea en lechones, provenientes de granjas porcinas donde esta afecci�n constituye un grave problema de dif�cil control. MATERIALES Y M�TODOS Cepas bacterianas, pl�smidos y bacteri�fagos Las cepas de E. coli (61) fueron obtenidas del intestino delgado de lechones con diarrea, provenientes de granjas porcinas ubicadas en los estados Aragua, Carabobo y Miranda (Figura 1), con edades comprendidas entre 1 a 5 semanas y fueron , analizadas en el Laboratorio de Bacteriolog�a del Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP). Estas cepas salvajes de E. coli eran portadoras del fenotipo lactosa positiva y sensibles al �cido nalid�xico (lac+ , NaIS) .Las cepas de E. coli auxotrofas utilizadas aparecen descritas con sus caracter�sticas en el Cuadro 1. Los pl�smidos utilizados y su origen aparecen descritos en el Cuadro 2. El bacteri�fago MS2 fue obtenido del cepario del Laboratorio de Microbiolog�a y Gen�tica de la Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Aislamiento y caracterizaci�n El an�lisis bacteriol�gico se realiz� por siembras directas del intestino delgado en lechones en medios diferenciales y las cepas aisladas fueron caracterizadas bioqu�micamente empleando la metodolog�a descrita por Edwards y Ewing (5) y koneman et al. (12).
Se analiz� la susceptibilidad de 61 cepas de E. coli frente a 14 agentes antimicrobianos siguiendo la metodolog�a descrita por Bauer y Kirky (2). Los antimicrobianos utilizados y sus concentraciones fueron �cido nalid�xico, AN (30 mcg); ampicilina, Am (10 mcg) ; cefalotin, CF (30 mcg) ; colistin, CI (10 mcg) ; cloranfenicol, Cn (30 mcg); gentamicina, Gm (10 mcg); kanamicina, Km (30 mcg); neomicina, Nm (30 mcg); nitrofurantoin, Nf (300 mcg); polimixin B, PB (300 unid.); estreptomicina, Sm (10 mcg); tetraciclina, Tc (30 mcg); trimetropin-sulfametoxazole, Tsx (25 mcg) y triple sulfa, Ts (300 mcg). Se correlacion� los niveles de resistencia con la concentraci�n m�nima inhibitoria (CMI) para Am, Cn, Km, Sm y Tc mediante el m�todo de diluci�n en agar con un replicador de Steers (26), utilizando concentraciones seriadas de cada antimicrobiano expresadas en mcg/ml (25-50-100-250-500- 750-1 000-1 250-1 500- 1750-2000-2250 y 3000). Transmisibilidad de los determinantes de resistencia Este proceso se realiz� a trav�s de experimentos de conjugaci�n en medio s�lido a 30�C, bajo las condiciones descritas por Rodr�guez-Lemoine y Rowbury {20). Las cepas de E. coli salvajes (lac+, NaIS) fueron utilizadas como donantes y la cepa de E. coli K 12711 lactosa negativa y �cido nalid�xico resistente (lac-, NaIR) como receptora. La mezcla de conjugaci�n fue incubada a 30�C por dos horas y la selecci�n de transconjugantes se realiz� en placas de agar medio m�nimo, suplementado con los requerimientos nutricionales de la receptora, adicionado de �cido nalix�dico a una concentraci�n final de 40 mcg/ml. El antimicrobiano por cuyo determinante de resistencia se desea seleccionar, fue escogido en cada caso por cinco antimicrobianos cuya concentraci�n final fue para Am, Cn y Km 20 mcg/ml; Sm 30 mcg/ml y Tc 15 mcg/ml. Estas placas se incubaron a 37�C por 48 horas. La frecuencia de transmisi�n se determin� seg�n la relaci�n (f = T /DV) donde T es el n�mero de transconjugantes que desarrollan colonias en las placas de selecci�n, despu�s de 48 horas de incubaci�n y DV es el n�mero de donantes viables en la mezcla de conjugaci�n. Las colonias transconjugantes fueron aisladas por agotamiento en ausencia de presi�n selectiva y posteriormente se determin� el fenotipo de los pl�smido transferidos. Clasificaci�n de los pl�smidos R por incompatibilidad Se realiz� una clasificaci�n preliminar de los pl�smidos de resistencia presentes en las cepas de E. coli salvajes, de acuerdo con su capacidad de expresar el car�cter de inhibir la fertilidad de un factor F (Fi+). Estas pruebas de sensibilidad al fago MS2 se realizaron seg�n las condiciones descritas por Rodr�guez-Lemoine (21). Los pl�smidos de resistencia (R) grupo F (expresan el car�cter Fi+) fueron clasificados luego por incompatibilidad seg�n metodolog�a descrita por Datta (4). Las cepas transconjugantes constru�das por introducci�n de los pl�smidos R transmisibles se utilizaron como donantes con cada una de las cepas receptoras. Cepas de E. Coli portadoras de pl�smidos del tipo F grupo de incompatibilidad FI, FII, FIV y FV se utilizaron como receptoras. La conjugaci�n se realiz� igualmente a 30�C por dos horas en placas de agar medio m�nimo, suplementado con los requerimientos nutricionales de la receptora correspondiente en cada caso y el antimicrobiano por cuyo determinante de resistencia se desea seleccionar. La selecci�n de transconjugantes se determin� por aislamiento de al menos 16 clones en agar deoxicolato. La coexistencia estable y hereditaria de los pl�smidos entrantes y residentes fue continuamente analizada en ausencia de presi�n selectiva. RESULTADOS Cepas de Escherichia coli En este estudio se analizaron intestinos de lechones con diarrea cuyo diagnostico cl�nico fue colibacilosis porcina. Entre los microorganismos identificados E. coli fue el de mayor incidencia. Susceptibilidad a los agentes antimicrobrianos Todas las cepas (100%) mostraron resistencia m�ltiple exhibiendo resistencia al menos a tres antimicrobianos y m�ximo a once. Se determinaron 40 patrones de resistencia diferentes, los m�s comunes incluyen resistencia para 5(Am-Nf-Sm-Tc-Ts) y 9 (Am-Cn-Nf-Km-Nm-Sm-Tc-Tsx-Ts) marcadores de resistencia. Todas las cepas fueron resistentes a Sm- Tc y Ts; los antimicrobianos con m�s baja frecuencia fueron PB-Gm y CI (Cuadro 3). La concentraci�n m�nima inhibitoria (CMI) en las cepas salvajes fue alta, alcanzando valores entre 250-750 mcg/ml en la mayor�a de las cepas para Am-Cn-Km-Sm y Tc; niveles m�s altos se observaron en menor proporci�n (Figura 2). La CMI en las transconjugantes alcanz� niveles m�s bajos entre 25 y 750 rncg/ ml; niveles m�s altos se observaron en menor proporci�n (Figura 3). Transmisibilidad de los determinantes de resistencia identificados E1 43% de las cepas mostraron determinantes de resistencia ligados a pl�smidos transferibles. Los determinantes de resistencia mayormente ligados a pl�smidos transferibles fueron ampicilina, neomicina y triple sulfa. Ninguna de las cepas transfiri� nitrofurantoin y polimixin B (Cuadro 4). La frecuencia de estos determinantes gen�ticos de resistencia oscil� entre 0,47 x 10-5 y 8,2 x 10-1 indicando la presencia de pl�smidos con sistemas de conjugaci�n reprimidos y dereprimidos aun cuando est�n en mayor proporci�n pl�smidos con sistema de conjugaci�n reprimidos. Las cepas transconjugantes exhibieron el 100% de resistencia m�ltiple frente a 14 antimicrobianos utilizados, observ�ndose 29 patrones de resistencia, menos complejos que los observados en las cepas salvajes, siendo Am-Sm-Ts el patr�n m�s frecuentemente observado (Cuadro 5).
Clasificaci�n de los pl�smidos R conjugativos por pruebas de incompatibilidad Se analizaron 25 cepas transconjugantes que exhibieron el car�cter (Fi+), portadoras de 14 pl�smidos pertenecientes al grupo FV, lo que representa un 85,7% de todas las transconjugantes portadoras de pl�smidos R, tres pl�smidos pertenecientes al grupo FIV y dos pertenecientes al grupo FI. El pl�smido Ec 25-001 se ubic� en los grupos de incompatibilidad FIV y FV a la vez, ello sugiere la existencia de sistemas de compatibilidad compartidos en dicho pl�smido (Cuadro 6)
DISCUSION La resistencia a los agentes antimicrobianos ha sido se�alada en cepas de E. coli enteropat�genas y no enteropat�genas de origen humano y animal (8, 10, 11, 23, 28, 29). Los resultados obtenidos en esta investigaci�n demuestran que la resistencia m�ltiple es m�s frecuente que la resistencia simple. Ello se debe a que los genes que codifican resistencia se encuentran en elementos gen�ticos translocables denominados transposones, responsables de la acumulaci�n de genes de resistencia en los pl�smidos (7, 13, 24). La alta incidencia de resistencia a estreptomicina, tetraciclina y triple sulfa podr�a resultar del uso ampliamente difundido de estos agentes como aditivos en los alimentos de consumo para cerdos. Los �ndices elevados de frecuencia de resistencia encontrada para Am, Cn, Nf, Km, Nm y Tsx se pueden igualmente asociar a su amplio uso veterinario. Estos resultados coinciden con informes de diferentes pa�ses los cuales revelan la amplia difusi�n de la resistencia a nivel mundial (11,16, 22, 28, 29). Los niveles altos de resistencia observados en estas cepas de E. coli evidencian la poca probabilidad de �xito en la terapia de la colibacilosis porcina, en las granjas analizadas, mediante el uso de estas drogas. Investigaciones previas (9, 25) revelan adecuada sensibilidad de las cepas de E. coli a colistin y polimixin B; los resultados obtenidos confirman este hecho para polimixin B lo que representa una alternativa para el tratamiento de esta afecci�n; sin embargo, se se�ala resistencia y transmisibilidad, aunque en baja proporci�n, para colistin, lo cual puede asociarse al inicio de su uso como un terap�utico en la industria porcina venezolana. La mayor�a de los determinantes de resistencia fueron ubicados en pl�smidos conjugativos, garantizando la diseminaci�n de estos determinantes gen�ticos en la poblaci�n porcina. Este fen�meno se ha visto ampliamente favorecido por el uso indiscriminado de los antimicrobianos como promotores de desarrollo y terap�utico en la poblaci�n porcina. En este trabajo se identificaron los pl�smidos de resistencia sobre la base de pruebas de incompatibilidad. Este estudio preliminar demuestra que un pl�smido identificado como perteneciente al grupo de incompatibilidad FV est� ampliamente distribuido en las distintas granjas evaluadas. El pl�smido es portador de diferentes determinantes de resistencia, manteni�ndose en forma estable la resistencia para ampicilina, tetraciclina y triple sulfa. Ello sugiere que este pl�smido mantiene un ciclo cerrado en las granjas estudiadas y probablemente en todas las granjas porcinas de la regi�n, asegurando la prevalencia de los determinantes de resistencia en cepas de E. coli y en otras bacterias pat�genas para cerdos. SUMMARY A survey of drug resistance was carried out in Escherichia coli strains isolated from diarrheic piglets. It was found that multiresistance in 27 porcine farms of the Central Region (Aragua, Carabobo and Miranda states) was produced by conjugative plasmids belonging to incompatibility groups FV (85%), FIV (8,5%) and FI (5,7%). The strains were resistant to streptomicyn, Sm (100%); tetracycline, Tc (100%); triple sulfa, Ts (100%); ampicillin, Am (75,4%); nitrafurantoin, Nf (65,5%); kanamycin, Km (59%); neomycin, Nm (55,7%); trimethoprim-sulfametoxazole, Tsx (55,7%); chloramphenicol, Cn (52,4%); cephalotin, Cf (37,7); colistin, CI (19,6%) 2 gentamicin, Gm (3%) and polimixin B, PB (1 ,6%). It was determined that a basic stable resistance pattern (AM-Sm- Ts) was linked to conjugative plasmids. The high frecuency of multiresistance suggests that a strong selective pressure is being produced by the irrational usage of antimicrobial agents in porcine farms in Venezuela. BIBLIOGRAFIA 1. ALEXANDER, J. J. L. 1981. Piglet diarrhoea: a guide to diagnosis and control. Brit. Vet. J. (G. 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