Veterinaria Tropical, 12: 3-18. 1987

INMUNIZACIÓN DE BOVINOS ADULTOS CON UNA VACUNA DE Brucella abortus
CEPA 19 A DOSIS REDUCIDA

Verónica R. de Lord*, José Weismersheimer** y Espartaco Sandoval***

*FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. 
Instituto de Investigaciones Veterinarias
Apdo. 70. Maracay 2101. Venezuela
**Instituto Nacional de Investigaciones Pecuarias (INIP). Palo Alto México
***FONAIAP. Estación Experimental Falcón.

RESUMEN

Sueros de 298 bovinos vacunados y 149 infectados, de un rebaño lechero, en el cual la brucelosis no había sido erradicada, fueron usados para evaluar los efectos de la vacunación en adultos con la vacuna de Brucella abortus cepa 19 (3 x 10⁹ organismos viables, aplicada subcutáneamente) sobre la reducción de infección y títulos serológicos. Las muestras de suero de todos los bovinos fueron colectadas a los 15-30-60-90-180 y 210 días post-vacunación. Asimismo se tomaron muestras de leche de vacas sospechosas y/o reactores (para cultivos y prueba del anillo). Un antígeno de Brucella conteniendo polisacárido fue empleado en pruebas de inmunodifusión radial y doble. Con estas pruebas pudieron ser identificados bovinos infectados con B. abortus, en rebaños recientemente vacunados, en los cuales gran número de reactores fueron detectados por las pruebas diagnósticas estándar. Los resultados de seis pruebas serológicas muestran que la dosis reducida causa menos interferencia en los diagnósticos serológicos. El antígeno Poli B fue más específico, detectando bovinos infectados en adultos vacunados (30 días post-vacunación). Una estrategia útil puede ser el muestreo de bovinos usando la prueba de rivanol y la prueba de inmunodifusión con el antígeno Poli B para identificar animales infectados en rebaños recientemente vacunados. B. abortus biotipo 1 fue aislada de muestras de leche.

INTRODUCCIÓN

El control de las enfermedades debe realizarse con dos objetivos fundamentales: obtener mayor eficiencia en la producción de alimentos de origen animal y prevenir las enfermedades transmisibles al hombre, las cuales inciden negativamente en la producción y productividad.

Los métodos de control se basan, por lo general, en la aplicación de vacunas, eliminación de animales infectados y medidas orientadas a reducir los riesgos de infección.

En la actualidad, los métodos de inmunización más recomendados son la vacuna cepa 19 y la bacterina 45/20 de B. abortus, cada una con una serie de ventajas y desventajas. Asimismo, en lo que respecta a vacunar animales adultos y becerras, también existen ventajas y desventajas.

En la vacunación de adultos, la inmunidad en el rebaño es rápida, relativamente económica y fácil, pero existen más problemas de diagnóstico post-vacunal. La vacunación de becerras trae consigo inmunidad lenta del rebaño, es relativamente costosa, puede ser complicada y tiene un mínimo de problemas en el diagnóstico vacunal (3, 6, 19, 30). Tomando en cuenta que existen diferentes ventajas con respecto a la vacunación de todo el rebaño en un mismo día, se hace necesario una consciente elección del producto y el método a emplear. Sin embargo, es evidente que en hatos con numerosos animales, donde la prevalencia de infección es alta, sería recomendable vacunar adultos, previa eliminación de los animales reactores (23).

La vacuna cepa 19, como agente inmunógeno, ha sido reconocida por más de 30 años, siendo ampliamente usada en diferentes países para vacunar terneras, su eficiencia en bovinos adultos está bien documentada (7, 23, 24, 25, 26).

Se han realizado numerosos estudios orientados hacia la búsqueda de técnicas sencillas y específicas para el diagnóstico de brucelosis. Entre los aspectos que se han investigado con más interés están los métodos que permiten identificar anticuerpos originados como consecuencia del estímulo por la infección, a diferencia de aquellos producidos en respuesta a ulna vacunación (1, 2, 9, 10, 11, 15, 16).

Estudios recientes sugieren que el problema de persistencia de títulos de anticuerpos a Brucella, en bovinos adultos vacunados con cepa 19, puede ser disminuido al reducir el número de bacterias en la dosis de vacunación, lo cual no afecta el grado de resistencia a la brucelosis (4, 6, 7, 24, 25, 26, 30). Asimismo, investigaciones realizadas por Alton et al. (4) y Alton y Corner (5) revelan que vacas preñadas pueden ser inmunizadas en forma efectiva, utilizando 2,8 x 10⁸ células de cepa 19, con lo cual se logra reducir la respuesta serológica a la vacunación y no se detecta interferencia con la preñez. La inmunidad conferida con esta dosis baja fue apreciable con respecto a la vacunación con la dosis estandar, lo cual significa una gran resistencia a la infección (4, 5).

Las publicaciones recientes de Jones et al. (21) sugieren que el empleo de un antígeno de naturaleza polisacárido, extraído a partir de cepas rugosas de B. melitensis (cepa B115), proporciona un alto grado de especificidad al reaccionar con anticuerpos asociados con el proceso infeccioso, pero no con anticuerpos de origen vacunal. Por otra parte, los trabajos publicados, primero por Nicoletti (24, 25, 26) y después por Plommet et al. (28), sugieren que la vacunación con dosis reducida de la cepa 19 produce una respuesta inmunológica sólida, pero que los títulos de anticuerpos en el suero se reducen considerablemente a los seis meses después de la vacunación, lo que permite diagnosticar la enfermedad mediante métodos convencionales, después de transcurrido este lapso de tiempo. Sin embargo, los estudios realizados por Díaz et al. (15, 16), utilizando el antígeno Poli B, permiten diferenciar, después del mes de vacunación, niveles de anticuerpos que corresponden a vacunación o a infección.

En Florida se han realizado estudios para evaluar la vacunación de bovinos adultos con cepa 19 de B.. abortus, utilizando diferentes vías de aplicación y diferentes dosis. Los efectos de la vacunación fueron evaluados por estudios bacteriológicos y cinco métodos serológicos. Las observaciones estaban dirigidas a establecer si había persistencia de la cepa 19, posibles pérdidas en la producción láctea, así como problemas abortivos (23, 24). Se observó que los problemas de interferencia en el diagnóstico serológico, causado por la vacunación en adultos con cepa 19, disminuyeron mediante el uso de la dosis reducida y pruebas serológicas complementarias. Por otra parte, se comprobó que no es recomendable vacunar al final de la lactancia, ya que hay menor protección y la vacuna es menos efectiva (24).

Estudios realizados por Nicoletti et al.(24, 25) y Viana et al.(29), comparando la dosis estándar y reducida aplicada por vía subcutánea y conjuntival, y probando los bovinos por serología y bacteriología, confirmaron los estudios de Plommet y Fensterbank (28) quienes revelaron que la vacunación de adultos a dosis reducida es confiable.

Investigaciones recientes sugieren que en rebaños vacunados con cepa 19, a dosis reducida, se ha logrado disminuir en un porcentaje significativo el número de vacas infectadas.

La cepa 19 se aisló de secreciones en menos del 1 % de vacunados durante la primera prueba post-vacunal y más tarde todas resultaron negativas, tanto en serología como en bacteriología (4, 5, 6, 26).

Asimismo, la prueba de la tarjeta resultó bastante sensible para emplearse como método único en la identificación de reactores, mientras que la prueba de fijación de complemento es menos sensible, razón por la cual se recomienda esta última como método de prueba en animales vacunados en edad adulta con dosis reducida.

Se ha comprobado que la vacunación prácticamente elimina la enfermedad clínica y reduce la exposición a la infección de los bovinos susceptibles, encontrándose una reducción de la infección en el 80% del rebaño a los seis meses post-vacunación (2, 4, 8), lo cual confirma que la administración de cepa 19 no altera el curso de la enfermedad en bovinos en etapa de incubación.

Esta investigación se enfocó hacia la evaluación de una vacuna a dosis reducida, aplicada vía subcutánea en bovinos adultos, así como al estudio de diferentes pruebas utilizadas en el diagnóstico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para alcanzar los objetivos fijados en este estudio, se emplearon los siguientes procedimientos:

A. Producción de Antigeno Poli B

Se utilizó una cepa rugosa (B115) de B. melítensís, la cual fue cultivada en botellas de Roux conteniendo medio sólido de Tripticasa Soya o en fermentadores automáticos con medio líquido, siguiendo las técnicas recomendadas por Alton et al. (3).

Después de 48 horas de incubación se cosechó el crecimiento bacteriano con una solución 0,15 de NaCl, se lavó y centrifugo dos veces a 5000 g durante 30 minutos. Las células fueron resuspendidas en agua deionizada; un volumen igual de Ácido Tricloroacético 0,5 fue agregado manteniendo la suspensión a 4°C durante 18 h con agitación constante. Posteriormente fue centrifugado a 5000 g durante 30 minutos a 4°C. El sedimento fue eliminado, mientras que al sobrenadante se le ajustó el pH, agregándole 5 volúmenes de Etanol al 95% (a 4°C); con el fin de propiciar un proceso de precipitación la mezcla se dejó reposar a 4°C durante la noche. Posteriormente fue centrifugadoa 5000 g durante 10 minutos lo que permitió formar un paquete con el precipitado de aspecto blanquecino. El sobrenadante fue eliminado mientras que el sedimento fue suspendido en una proporción de 1:10 con respecto al volumen original, el pH se ajustó a 7 con NaOH 1M y 0,1M, respectivamente.

El producto obtenido se sometió a un proceso de diálisis contra agua deionizada a 4°C, durante 5 días, con cambios cada 4 horas. Finalmente se procedió a centrifugar a 10000 g durante 30 minutos, después de 10 cual se eliminó el sedimiento. El sobrenadante fue considerado el Antígeno Polisacárido extraído de la pared celular de B. melítensís (Técnica descrita originalmente por Díaz et al. 16).

B. Determinación de la concentración de azúcares del polisacárido

Para conocer la cantidad de azúcares totales contenido en cada mililitro de solución de antígeno, se utilizó H₂SO₄ al 95%, Fenol al 5% solución glucosada (conteniendo 10, 20, 30, 40, 50.60, 70 mg de glucosa) y solución del Antígeno Poli B, según técnica de Dubois et al. (17). La lectura se hizo en un espectrofotónietro a 490 nm de absorbancia. La concentración final del polisacárido se determino por referencia a una curva estándar de glucosa.

C. Pruebas de Inmunodifusión

El antígeno fue evaluado en Prueba de Inmunoelectroforesis y Contrainmunoelectroforesis utilizando Veronal buffer, pH 8,6 en agarosa al 0,8%, al cual se le agregó 10% de NaCl (9).

La prueba de Inmunodifusión doble (Ouchterlony) fue preparada en agarosa al 1% con buffer de Borato pH 8,3, conteniendo 10% de NaCI (27).

La prueba de Inmunodifusión Radial (Mancini) se preparó con agrosa al 1,8% en buffer de Glicina al 0,1M, con un pH de 8,6, a una concentración de 20% de NaCl. Un volumen igual de gel y solución de Poli B fue mezclado y se mantuvo a 65°C; fue repartido en portaobjetos y/o placas de Petri, a las cuales se les perforó orificios entre 3-4 m m de diámetro y profundidad. Una vez agregados los sueros se mantuvo en una cámara húmeda a la temperatura ambiente. El óptimo de concentración de Poli B estuvo entre 73-292 µ g/ml de gel el cual fue probado con 24 sueros control. Todo fue realizado siguiendo las técnicas de Díaz et al. (16), y Jones et al. (21).

D. Pruebas Serol6gicas

Se utilizaron seis pruebas serológicas: algutinación rápida (placa) y lenta (tubo), 2-Mercapoetanol, rivanol, card test y fijación de complemento, con un antígeno particulado de B. abortus cepa 1119-3. Los procedimientos utilizados en cada prueba son los descritos por Alton et al. (2).

E. Pruebas Bacteriológicas

Se sembraron 149 muestras de leche procedentes de bovinos no vacunados, considerados infectados por altos títulos serológicos y por haber resultado positivos a la prueba del anillo (ring test) y 18 muestras de bovinos vacunados, positivos en las pruebas de inmunodifusión y complementarias. Cada una de las muestras fue sembrada en cuatro diferentes medios de cultivos: Agar Albimi, Triptosa, Tripticasa Soya y Kuzdas Morse a los cuales se les había agregado 5% de suero fetal bovino.

Las placas fueron incubadas a 37°C durante diez días en atmósfera de 10% de CO₂, siendo examinadas diariamente a partir de las 48 horas post-inoculación. Las colonias fueron observadas en un microscopio estereoscópico de acuerdo con el método de Henry (Alton et al., 2); aquellas colonias sospechosas de ser Brucella fueron teñidas con la tinción de Gram y Koster (Alton et al., 2).

Varias colonias de cada muestra fueron cosechadas e inoculadas sobre Agar Papa y Tripticasa Soya, siendo incubadas a 37° para determinar dependencia de CO₂ y crecimiento sobre medios conteniendo 5% de suero fetal de bovino. Las colonias aisladas se sometieron a pruebas bioquímicas generales y especiales: acriflavina (1:1 000) inundación con cristal violeta (1:40), ureasa, catalasa, oxidasa, producción de H₂S y citrato (2, 22).

Las cepas identificadas como Brucella fueron sometidas a las pruebas de sensibilidad a colorantes utilizando solución de fucsina básica al 0,1%, diluciones 1:25 000, 1:50 000, 1:100 000; tionina a la misma concentración y dilución; safranina a11% (dilución 1 :5000) en Agar Albimi. También fueron sembrados en medios conteniendo l-Eritritol (1 mg/ml) y Penicilina (5 UI/ml).

Los medios fueron inoculados con una suspensión bacteriana preparada con solución de NaCl al 0,85% y una densidad similar a las cepas de referencia (B. abortus 544-2, B. melitensís 16M, B. suís 1330). Sueros monoespecíficos (Anti-A y Anti-M) fueron utilizados para determinar qué tipo de aglutininas predominaba en las cepas aisladas.

El fago Tbilisi fue usado en dos diferentes concentraciones: dosis habitual de prueba (DHP) y 10000 x DHP (12, 20, 22).

F. Sueros de bovinos

Se examinaron 1 788 muestras de suero de animales, correspondientes a 298 bovinos vacunados a la edad adulta (9 -14 meses), procedentes de un muestreo realizado en cuatro fincas con una alta prevalencia de brucelosis. Asimismo se probaron 149 muestras de suero de animales infectados en forma natural, que en muestras de leche habían resultado positivos a la prueba de anillo y en los cuales posteriormente se demostró1a presencia de Brucella, aislada a partir de muestras de leche.

G. Vacuna Cepa 19 a dosis reducida

Las 298 vacas. serológicamente negativas, fueron vacunadas con una dosis reducida de 3 x 10⁹ células viables de B. abortus cepa 19 (vacunaliofilizada elaborada por un labáratorio privado), aplicada por vía subcutánea. Las muestras de suero post-vacunación se obtuvieron a los 15-30-60-90-180 y 210 días.

Todos los sueros se sometieron a pruebas inmunológicas para demostrar presencia o no de anticuerpos contra Brucella.

RESULTADOS

Se logró obtener 156 ml de antígeno polisacárido 8 a partir de la pared celular de una cepa rugosa (B115) de B. melitensis. El antígeno extraído se sometió a pruebas de colorimetría, resultando con una concentración del 79% de azúcares totales, expresados en relación a un estadar de glucosa. Cuando se evaluó el polisacárido con las pruebas de inmunoelectroforesis y contrainmunoelectroforesis, se pudo demostrar la presencia de una línea simple, con movilidad catódica.

El antígeno fue probado con 24 sueros controles, conocidos de ser positivos y/o negativos, observándose líneas de precipitación solamente en los sueros de animales infectados. Las pruebas de Inmunodifusión Radial (Mancini) y doble Ouchterlony se utilizaron para evaluar 1 788 muestras de sueros, correspondientes a 298 bovinos adultos vacunados y 149 no vacunados, conocidos de estar infectados cuando fueron analizados con la prueba del anillo, así como los altos títulos de anticuerpos detectados en las diferentes pruebas serológicas.

Se pudo observar líneas de precipitación en 18 sueros de bovinos vacunados a partir de los 30 días post-vacunación, lo cual sugiere que probablemente estaban incubando la infección cuando fueron vacunados (Figs. 1 y 2).

Un total de 135 sueros (90,60%), provenientes de los bovinos no vacunados, desarrollaron líneas de precipitación lo cual coincidió con todos aquellos positivos en las pruebas de fijación de complemento y card test, observándose además 14 animales con bajos títulos de anticuerpos en las prueba rápida y lenta de aglutinación y negativos tanto en fijación de complemento como en card test, no siendo detectados por el antígeno Poli B (Cuadro 1) (Figs. 1 y 2).

En el Cuadro 2 se presenta la información correspondiente al comportamiento de 1 788 muestras de suero, 298 bovinos adultos vacunados con dosis reducida de 3 x 10⁹ células viables de B. abortus cepa 19, a los 15, 30, 60, 90, 180, 210 días post-vacunación.

Las diferentes pruebas de aglutinación alcanzaron el mayor número de reactores a los 15 días post-vacunación, lo cual fue reduciéndose gradualmente hacia el tercer mes post-vacunación. La prueba de card test mostró una gran sensibilidad, observándose que 57 animales (19,12%) permanecieron positivos, aún a los siete meses post-vacunación 18 animales de los detectados eran infectados.

Las pruebas de aglutinación detectaron el mayor número de reactores en las muestras colectadas a los 15 días post-vacunación, 3200, 1600, 800, 400 y 200 UI; a los 30 días, títulos de 800, 400, 200 y 100 UI a los 60 días 200, 100 y 50 UI, reduciéndose los niveles de anticuerpos, en forma gradual, hacia los 210 días post-vacunación.

La prueba de aglutinación lenta alcanzó a identificar 280 animales reactores (93,95%) a los 15 días, mientras que a los 60 días post-vacunación detectó 240 (80,53%); finalmente permanecieron 33 reactores (11,07%), de los cuales 18 (6,04%) presentaron títulos de 1:50 y 1:200 aún después de los siete meses post-vacunación. Con la prueba de aglutinación rápida se detectaron 49 (16,44%), 18 por el antígeno Poli B.

Al analizar la prueba de 2-Mercaptoetanol, a los 30 días post-vacunación, se encontró un menor número de reactores (249) el cual fue reduciéndose hacia el sexto mes post-vacunación, cuando se detectaron 120 reactores (40,26%), persistiendo positivos 17 animales (5,70%) a los siete meses post-vacunación.

En relación con la prueba de rivanol, se observó que el mayor porcentaje de reactores (280) se detecta a los 15 días post-vacunación y todavía al sexto mes post-vacunación, 98 animales (32,88%) resultaron reactores, encontrándose al séptimo mes post-vacunación persistencia de anticuerpos en 15 animales (5,03%).

Con la prueba de fijación de complemento se detectaron altos niveles de anticuerpos a los 15 días post-vacunación, 832, 416, 208, 104, 52, 26 y 13 UI; a los 30 días post-vacunación, 416, 208, 104, 52, 26 UI; a los 60 días post-vacunación algunos animales incrementaron sus títulos mientras que otros disminuyeron, 1664, 416, 208,104, 52, 26, 13 UI y es a partir de los 90 días post-vacunación cuando se observa un importante descenso en los niveles de anticuerpos, 208, 104, 52, 13 UI. A los seis meses post-vacunación, estos títulos continúan descendiendo gradualmente (104, 52, 26, 13 UI) observándose que en 17 animales (5,70%) hay una persistencia en los niveles de anticuerpos hasta el séptimo mes post-vacunación.

En el Cuadro 3 se puede observar la persistencia de niveles de anticuerpos detectados por las pruebas de seroaglutinación, fijación de complemento e inmunodifusión, a los 210 días post-vacunación, en 18 bovinos vacunados (6,04%).

Al analizar todos los resultados obtenidos tanto en bovinos vacunados como no vacunados (infectados), se puede observar una correlación entre las pruebas de Inmunodifusión, fijación de complemento, card test, 2-Mercaptoetanol y rivanol, pero la misma es más relevante entre las tres primeras.

La prueba del anillo resultó positiva en 143 (95,97%) de los 149 animales infectados bajo estudio, mientras que en los exámenes bacteriológicos resultaron positivas 84 (56,37%) muestras de leche en bovinos no vacunados y 15 (83,33%) de los 18 vacunados mostraron persistencia de niveles de anticuerpos, aislándose B. abortus biotipo 1, que por mostrar necesidad de CO₂ en su primer aislamiento y crecer en l-Eritritol (1 mg/ml de medio) fueron consideradas cepas de campo.

En el Cuadro 4 se presenta el porcentaje de reactores en cada una de las pruebas serológicas e inmunodifusión desde los 15 días hasta los 210 días post-vacunación, observándose que la prueba de inmunodifusión con el antígeno Poli B resultó ser muy sensible y específica, al detectar a los 30 dias post-vacunación 18 animales infectados dentro del grupo de los vacunados.

DISCUSIÓN

En el presente estudio se observó que el 90,60% de bovinos vacunados con 3 x 10⁹ de la cepa 19 desarrollaron títulos elevados de anticuerpos, mientras que un 6,7% desarrollaron bajos niveles de anticuerpos (1/25 hasta 1/50), lo cual se considera reacciones individuales, posiblemente debido a problemas de inmunodepresión, de ninguna manera relacionados con el inmunógeno ya que se demostró que el 90,60% de los animales tuvo una excelente respuesta inmune. Asimismo, se detectó en 18 animales (6,04%) una persistencia de altos niveles de anticuerpos (1/25 hasta 1/200).

La prueba de card test fue muy sensible detectando 57 animales reactores (19,12%) aún después del séptimo mes post-vacunación, lo cual sugiere que solamente con esta prueba no se debe evaluar sueros procedentes de bovinos adultos vacunados con dosis reducida. La prueba de aglutinación lenta identificó igual nú mero de reactores al séptimo mes post-vacunación, pero los bajos títulos detectados en 15 animales y el hecho de no ser detectados por Poli B, sugieren ser de vacunación, mientras que 18 animales que persistían con títulos de 1:100 sugerían infección, lo cual fue confirmado con las pruebas de inmunodifusión con antígeno Poli B, prueba del anillo y bacteriología.

Por su parte, 2-Mercaptoetanol y rivanol, al séptimo mes post-vacunación, continuaron detectando anticuerpos en 17 y 15 bovinos vacunados (títulos de 1:251 hasta 1 :100), siendo los mismos detectados por fijación de complemento, card test e inmunodifusión, comprobándose la infección.

CONCLUSIONES

-La vacunación de bovinos adultos con dosis reducida de Cepa 19 puede ser una herramienta práctica y útil en caso de rebaños con una alta prevalencia de brucelosis.

-Los problemas de interpretación serológica pueden ser disminuidos con el uso de una dosis reducida de la cepa 19 y pruebas complementarias.

-Las pruebas de inmunodifusión en gel, utilizando un antígeno polisacárido, junto con las pruebas de rivanol, serían los métodos serológicos recomendados cuando se vacunan bovinos de edad adulta.

-El porcentaje de reactores puede ser disminuido en etapa temprana con el uso del antígeno Poli B, el cual permite diferenciar anticuerpos infecciosos de aquellos de origen vacunal.

-El uso de la dosis reducida para vacunación puede ser extendida en los próximos años, constituyendo una importante contribución en los esfuerzos hacia el control y erradicación de la brucelosis.

SUMMARY

Sera of  298 vaccinated and 149 infected bovines, from a dairy herd from which brucellosis had not been erradicated, were used to evaluate the effects of the vaccination of adults with the vaccine of Brucella abortus strain 19 ( 3 x 10⁹ viable organisms, applied subcutaneously) on the reduction of infection and serologiccal titers. Serum samples of all the bovines were collected at 15-30-60-90-180 and 210 days postvaccination. Likewise samples of milk were take from suspicious and/or reactor cows (for culture and ring test). An antigen of Brucella containing polysaccharide was employed in radial and double inmunodiffusion tests. With these tests it was possible to identify bovines infected with B. abortus in recently vaccinated herds in which a great number of reactors were detected by the standard diagnostic tests. The results of six serological tests showed that the reduced dose caused less interference in the serological diagnoses. The Poly-B antigen was more specific, detecting infected bovines in vaccinated adults (30 days postvaccination). A useful strategy might be the sampling of bovines using the rivanol test and the inmunodiffusion test with the Poly-B antigen to identify infected animals in recently vaccinated herds. B. abortus biotype 1 was isolated from milk samples.

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