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Veterinaria Tropical 13: 15-24.1988 BABESIOSIS BOVINA: EFECTO INMUNOPROTECTOR DE UN EXOANTIGENO DE Babesia bigemina OBTENIDO EN CONDICIONES DE LABORATORIO1 M. Toro Benítez*, S. Montenegro-James**, E. León Arenas*, R.
López Boyer* y M. Rístíc** *FONAIAP Centro Nacional de Investigaciones
Agropecuarias. Recibido: agosto 29, 1988. |
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RESUMEN Se reseñan los resultados obtenidos al examinar comparativamente, en animales susceptibles, la capacidad inmunoprotectora de exoantígenos de Babesia bigemina y B. bovis, derivados del cultivo in vitro. Bovinos susceptibles, mestizos Holstein, de aproximadamente 15 meses de edad, fueron vacunados con diferentes dosis de exoantígeno (10, 5 y 1 ml-equivalentes) y desafiados con cepas virulentas heterólogas de B. bigemina y B. bovis, respectivamente. El exoantígeno se administró por vía sub-cutánea, en dos dosis con intervalo de tres semanas. Los principales parámetros utilizados para evaluar la inmunidad inducida fueron: período prepatente, reducción máxima del hematrocito y ganancia neta de peso corporal post-desafío. Los resultados mostraron una fuerte protección en todos los animales vacunados con dosis equivalentes a 10 ml de sobrenadante de cultivo de B. bigemina y/o B. bovis. La dosis óptima vacunal para B. bovis, en desafío heterólogo, fue de 10 ml-eq., mientras que el exoantígeno de B. bigemina indujo protección significativa en todas las dosis utilizadas. El exoantígeno de B. bigemina mostró una buena capacidad de protección heteróloga y podría ser usado, junto al exoantígeno de B. bovis, en la elaboración de una vacuna bivalente para la prevención de la babesiosis bovina en Venezuela.
En los países tropicales y sub-tropicales, la ganadería bovina es afectada por dos especies de Babesia: Babesia bigemina (Smith y Kilbourne, 1893) y B. bovis (Babes, 1888), las cuales muchas veces actúan en forma concomitante con la aparición de infecciones mixtas en los rebaños (7,13,19). En Venezuela, la babesiosis bovina está ampliamente distribuida en todo el territorio nacional (21) y estudios epidemiológicos realizados demuestran que la B. bigemina tiene alta prevalencia en las explotaciones bovinas (7). En algunos países, la B. bigemina es considerada menos patógena y usualmente se trata de prevenir solamente la enfermedad causada por B. bovis; tal es el caso de Australia, donde más de 90% de los brotes de babesiosis son atribuidos a la especie B. bovis (2). En otros lugares, sin embargo, la patogenicidad de B. bigemina es relevante y los bovinos deben ser protegidos contra ambas especies (1,4,15). En Venezuela, la prevalencia e incidencia de B. bigemina es mayor que la de B. bovis y, en consecuencia, para alcanzar óptimos resultados en un programa de prevención contra la babesiosis bovina es necesario vacunar o inmunizar contra ambos hemoparásitos. Hasta hace poco, la prevención de la babesiosis bovina se hacia mediante el método de la "premunición", técnica de alto riesgo para los animales (16). Sin embargo, el desarrollo reciente de técnicas de cultivo in vitro para B. bovis (5,6,11) y B. bigemina (22) ofrece nuevas perspectivas para la elaboración de vacunas inactivadas contra la babesiosis, libres de contaminantes y de elementos parasitarios. Ensayos previos han demostrado una adecuada protecci6n en bovinos vacunados con inmunógenos de cultivo de B. bovis, frente al desafío con cepas homólogas (9,10,17,18). El objetivo de este trabajo fue conocer el efecto inmunoprotector de un exoantígeno de B. bigemina, obtenido de cultivo, comparándolo con un inmunógeno ya probado de B. bovis. Igualmente, determinar la dosis óptima vacunal en grupo de bovinos vacunados separadamente con exoantígenos de ambas especies.
Animales Experimentales Se utilizaron bovinos (Bos taurus) nativos, de alto mestizaje, de aproximadamente 15 meses de edad, susceptibles a la infección por B. bigemina y B. bovis, negativos serológicamente a la prueba de inmumofluorescencia indirecta (IFA). Los animales se mantuvieron en completo aislamiento, en galpones cerrados a prueba de vectores y se les suministró, durante toda la experiencia, alimento concentrado, heno, sales minerales y agua ad libitum. Adicionalmente, se usaron becerros esplenectomizados, de tres a cuatro meses de edad, para la reactivación de las cepas de B. bigemina y B. bovis. Cepas de Babesia Se utilizaron cepas de B. bigemina y B. bovis aisladas durante brotes de babesiosis ocurridos en diferentes regiones de Venezuela. Todas las cepas se mantuvieron como "estabilados criopreservados" después de ser pasadas, mediante jeringa, en animales esplenectomizados; y en cada caso se recolectó asépticamente sangre para el inicio de cultivos in vitro, la elaboración de frotis-antígeno para la prueba IFA y la preparación de inocula frescos para el desafío. Producción de Exoantígenos Las cepas de Babesia se cultivaron de acuerdo con los métodos descritos por Levy y Ristic (11) y Vega et al. (22) para B. bovis y B. bigemina, respectivamente, iniciándose los cultivos con un 10% de eritrocitos infectados suspendidos en 80% y 60% de medio 199, suplementado con 20% (B. bigemina) o 40% (B. bovis) de suero bovino normal y otros aditivos. La suspensión, a un pH de 7,2, se incubó en un ambiente húmedo (95%) y atmósfera de CO2 (3%). Las parasitemias promedios, en un ciclo de cultivo de 72 horas, fueron de 3% para B. bigemina y 8% para B. bovis. El sobrenadante cultivado, centrifugado y filtrado (0,45µ m) fue liofilizado y almacenado a 4°C, previa adición de 1,5 mg de saponina Quil-A como adyuvante por dosis. Diseño Experimental Veinte y cuatro bovinos mestizos, divididos en grupos de 12 animales cada uno, fueron inoculados separadamente con exoantígenos de B. bigemina y B. bovis, recibiendo dosis de 10 ml-eq. (sub-grupo I, n= 4),5,0 ml-eq. (sub-grupo II, n= 4) y 1,0 ml-eq. (sub-grupo III, n= 4), respectivamente. Cada dosis contenía 1,5 mg de saponina Quil-A como adyuvante y se administró, por vía sub-cutánea, los días 0 y 21. Ocho bovinos no vacunados se incluyeron como testigos negativos. Tres meses después de la segunda dosis vacunal, todos los bovinos (12 vacunados y 4 controles en cada grupo) fueron desafiados, por vía endovenosa, con 109 organismos virulentos de B. bigemina y B. bovis (especies homólogas, cepas heterólogas). Recolección y Análisis de datos Durante todo el experimento se determinaron los siguientes
parámetros: temperatura corporal, hematrocito, parasitemia (en frotis
delgados coloreados por Giemsa) y título de anticuerpos específicos,
según técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFA) descrita por
James et al. (8). El peso corporal se midió mensualmente antes del
desafío y bisemanalmente después de la inoculación. Los resultados
se analizaron y compararon mediante la prueba estadística de
significancia "t". RESULTADO Y DISCUSIÓN En la Figura 1 se muestra la respuesta de anticuerpos específicos durante el período de vacunación y post-desafío, en bovinos vacunados con exoantígeno de B. bigemina. Después de la vacunación, los bovinos reaccionaron con títulos IFA inferiores a los observados en el grupo de bovinos vacunados con exoantígeno de B. bovis. El título máximo alcanzado en bovinos vacunados con dosis de 10 ml-eq fue de 1: 2560 (Fig.2). La respuesta de anticuerpos, en bovinos vacunados con exoantígenos de B. bovis, en dosis de 5,0 ml-eq, resultó intermedia entre las producidas con dosis de 10,0 ml-eq y 1,0 ml-eq (Fig. 2). Por otra parte, el exoantígeno de B. bigemina, administrado en dosis de 5,0 ml-eq y 1,0 ml-eq, produjo una respuesta de anticuerpos muy similar en todo el período post-vacunal. En todos los animales vacunados se observó una muy buena respuesta anamnéstica después del desafío, indicativa de una eficiente sensibilización frente a las cepas de Babesia utilizadas como desafío. La protección conferida por los exoantígenos de B. bigemina y B. bovis, frente al desafío con cepas heterólogas, se midió fundamentalmente comparando, entre vacunados y controles, los siguientes parámetros: duración de parasitemia, reducción máxima del hematrocito y ganancia neta de peso corporal. En el Cuadro 1 se presentan en forma comparativa los resultados obtenidos con ambas especies de Babesia. En bovinos vacunados con exoantígeno de B. bovis, en dosis de 10 ml-eq., se observó una fuerte protección frente al desafío heterólogo, mientras que, en bovinos vacunados con exoantígeno de B. bigemina se constató una buena protección similar en todos los niveles de dosis utilizadas. Lo más característico en todos los animales vacunados fue la rápida desaparición de los hemoparásitos en sangre, siendo significativa la diferencia entre vacunados y controles (P < 0,05). Así, en bovinos vacunados con exoantígeno de B. bovis (10 ml-eq/dosis) se constató una corta duración de parasitemia (1,7 días en vacunados versus 7,0 días en controles). Igual observación pudo hacerse en animales vacunados con exoantígeno de B. bigemina (10 ml-eq/dosis), sub-grupo en el cual se notó una duración de parasitemia de 2,5 días de los vacunados contra 11,0 días de los controles. El exoantígeno de B. bovis, en dosis de 5,0 ml-eq y 1,0 ml-eq., resultó me- nos eficiente al ser analizada la reducción máxima del hematocrito (10 ml-eq= 29%; 5,0 ml-eq= 39% y 1,0 ml-eq= 38%). Sin embargo, estos animales retornaron rápidamente a sus valores normales, lo cual sugirió la presencia de un fenómeno de congestión vascular mas que una masiva destrucción de eritrocitos. Los animales, en todos los sub-grupos vacunados, ganaron peso durante todo el período de post-desafío, con diferencias significativas en relación con los controles, los cuales, por el contrario, perdieron peso (P < 0,05).
La vacunación con inmunógenos solubles derivados del cultivo in vitro de B. bovis ha demostrado que es posible inducir una sólida protección clínica frente al desafío con cepas homólogas (9,10,17,18) y heterólogas (14, 20). Sin embargo, siendo la inmunidad protectiva en babesiosis esencialmente especie-específica, no se presenta una completa protección cruzada entre las diferentes especies que conforman la familia Babesia (19,23). En consecuencia, el objetivo de esta investigación fue conocer el efecto inmunoprotector de un exoantígeno de B. bigemina, cepa venezolana, en comparación con un exoantígeno ya probado de B. bovis. Los resultados mostraron que hubo una buena protección heteróloga en todos los bovinos vacunados a una dosis óptima de 10 ml-eq. para exoantígeno de B. bigemina o B. bovis. En dosis menores, el exoantígeno de B. bovis fue menos eficiente para inducir una completa respuesta protectiva. Por el contrario, el exoantígeno de B. bigemina indujo una respuesta protectiva similar en todas las dosis utilizadas (10 ml-eq., 5,0 ml-eq., y 1,0 ml-eq), indicando una mayor resistencia de los animales vacunados al desafío con una cepa heteróloga de B. bigemina. La persistencia de la infección y la recrudescencia de parasitemias son a menudo demostraciones de la variación antigénica de los parásitos (12) yen este sentido se ha probado que B. bovis tiene una mayor capacidad de variación que B. bigemina (3). Igualmente, los resultados indicaron que en la babesiosis bovina, causada por B. bovis, la inmunidad específica protectiva tendría una mayor dependencia del tipo de cepa que en la babesiosis causada por B. bigemina. Resultó evidente que la inoculación con exoantígenos de B. bigemina y B. bovis, adicionados de un potente adyuvante, protegió eficientemente a los bovinos frente al desafío con especies homólogas, siendo una importante característica de la inmunidad protectiva conferida, la eliminación rápida de los parásitos de la circulación sanguínea y la capacidad para resistir las manifestaciones clínicas de la infección, demostrada entre otros factores por la ganancia de peso corporal post-desafío. En B. bovis, la inoculación de 10 ml-eq. de exoantígeno resultó la dosis óptima para asegurar una completa protección heteróloga. Sin embargo, sería necesario realizar estudios comparativos entre aislamientos de B. bovis de diferentes regiones del país para una mejor selección de cepas a los fines de producción de vacunas con amplio espectro de aplicación en todo el ámbito nacional. En conclusión, el exoantígeno de B. bigemina mostró una capacidad protectiva eficiente contra los efectos clínicos de la enfermedad y, en consecuencia, su utilización como vacuna junto a exoantígenos similares de B. bovis constituirá una forma eficaz, inocua y sencilla de proteger a los bovinos contra la babesiosis.
The comparative protective efficacy of culture-derived Babesia bigemina and B. bovis exoantigens, in susceptible cattle, is reported. Susceptible mixed-Hoistein yeraling cattle were vaccinated with different doses of exoantigens (10,5 and 1 ml-equivalente) and challenged with virulent heterologous B. bigemina and B. bovis strains, respectively. Exoantigen was given by sub-cutaneous route in 2 doses at 3 weeks intervals. Majar parameters used to evaluate induced protection were: prepatent period, packed cell volume maximal reduction, and net gain in bodyweightafter challenge exposure. Results showed a strong protection in all animals vaccinated with 10 mleq. dose of either B. bigemina for B. bovis exoantigen-containing supernatant fluids. The optimal vaccinal dose for B. bovis, to heterologous challenge, appears to be 10 ml-eq.; whereas, B. bigemina exoantigen induced significant protection at all dose levels. lt is concluded that B. bigemina showed a good capacity to induce heterologous protection and it could be used, in addition to B. bovis exoantigen, to make a bivalent vaccine to prevent bovine babesiosis in Venezuela.
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