BABESIOSIS BOVINA: EFECTO INMUNOPROTECTOR DE UN EXOANTIGENO DE Babesia bovis (=B argentina) OBTENIDO MEDIANTE CULTIVO IN VITRO

Veterinaria Tropical 13: 69-82.1988

BABESIOSIS BOVINA: EFECTO INMUNOPROTECTOR DE UN EXOANTIGENO DE Babesia bovis (=B argentina) OBTENIDO MEDIANTE CULTIVO IN VITRO¹

M. Toro Benltez*, S. Montenegro-James**, E. León Arenas, R. López Boyer* y M. Ristic**

*FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias.
Apdo. 70- Las Delicias. Maracay 2102. Venezuela.
**Universidad de Illinois. College of Veterinary Medicine
Departament of Veterinary Pathobiology. Urbana. IIlinois 61801. E.U.A.
¹ Investigaciones auspiciadas por Convenio FONAIAP
Universidad de IIlinois (E.U.A.).

Recibido: junio 29, 1988.

RESUMEN

Se presentan los resultados obtenidos al examinar en bovinos susceptibles la capacidad de protección homóloga y heteróloga de un exoantígeno de B. bovis, cepa venezolana, obtenido mediante cultivo in vitro. Bovinos susceptibles, mestizos Holstein, de 18 meses de edad, fueron inoculados con exoantígeno de B. bovis y desafiados con cepas de B. bovis de Venezuela, Ecuador, Argentina, Colombia y México. El exoantígeno se administró por vía sub-cutánea, en dos dosis con intervalo de tres semanas y la protección se midió sobre la base de la determinación de los siguientes parámetros fisiopatológicos: período pre-patente, nivel y duración de parasitemia, duración del estado febril, disminución del hematocrito, presencia de criofibrinógeno plasmático, niveles de anticuerpos homólogos y heterólogos séricos específicos y ganancia neta de peso corporal, post-desafío. Los resultados mostraron un buen grado de protección frente al desafío con las cepas de Venezuela (homóloga), Ecuador (heteróloga) y Argentina (heteróloga); sin embargo, hubo una protección heteróloga deficiente frente a las cepas de Colombia y México. Se concluye que el uso de exoantígenos de cultivo como método inmunoprofiláctico constituye una técnica inocua y sencilla para la protección de los bovinos contra la babesiosis.

INTRODUCCIÓN

En Venezuela, la babesiosis bovina es causada por dos especies de hemoparásitos: Babesia bigemina (Smith y Kilbourne, 1893) y B. bovis (Babes, 1888), los cuales evolucionan en los eritrocitos de los bovinos susceptibles, provocando un cuadro febríl agudo, anemia severa, hemoglobinuria y, ocasionalmente, signos nerviosos.

Esta infección está ampliamente difundida en el país (33), manteniendo generalmente los animales nativos una relación de "estabilidad enzootica" la cual previene, hasta cierto grado, la aparición de cuadros clínicos graves en los rebaños. Sin embargo, bajo ciertas condiciones puede presentarse la enfermedad y, en particular, cuando animales de zonas libres (bovinos importados por ejemplo) son introducidos en zonas infectadas.

Hasta hace poco, se creyó que la única forma de inducir y conservar la inmunidad contra la infección era a través de un estado co-infeccioso, constituyendo la premunición o premunidad" el método tradicional de inmunización contra la babesiosis (28). No obstante, se ha comprobado que la inmunidad puede subsistir después de la eliminación del agente causal en el hospedador (3, 6, 18, 24, 32) y que es posible, además, inducir inmunidad contra Babesia sp. mediante la inoculación de materiales parasitarios no viables (14,19,20,21,25).

Otros métodos para la prevención de la babesiosis han consistido en la alteración de la virulencia de los parásitos (B. bovis, B. major, B. divergens) por pasajes repetidos en becerros esplenectomizados (7) o por tratamiento con irradiación (26,27). Estos métodos, aunque eficientes, han presentado sin embargo serias desventajas tales como: infectividad variable y reacciones clínicas severas post-vacunación (5) y corta duración del efecto protector (23), lo cual representa un obstáculo para su uso.

El desarrollo de una técnica para el cultivo y propagación in vitro de 8abesia bovis (1,2,17) ha abierto un nuevo campo para la elaboración de vacunas inactivadas, libres de contaminantes y de elementos parasitarios contra la babesiosis. Ensayos previos han demostrado un grado eficiente de protección en bovinos vacunados con inmunógenos obtenidos del cultivo in vitro de B. bovis, frente al desafío con organismos virulentos de cepas homólogas (15,29,30).

En el presente trabajo se reseña el efecto inmunoprotector, en bovinos vacunados, de un exoantígeno de cultivo elaborado con una cepa venezolana de B. bovis, así como también, la protección vacunal frente al desafío con cepas provenientes de diferentes regiones de Latinoamérica.

MATERIALES y MÉTODOS

Animales Experimentales Se utilizaron bovinos (B0s taurus) mestizos Hoistein, de aproximadamente 18 meses de edad, susceptibles a la infección por B. bovis, negativos a la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFA). Los animales se mantuvieron en galpones cerrados, en completo aislamiento y se les suministró alimento concentrado, heno, sales minerales yagua ad libitum. Adicionalmente, se utilizaron becerros esplenectomizados, de tres a cuatro meses de edad, como reactivadotes de las cepas de B. bovis.

Cepas de B. bovis

Las cepas de B. bovis, en forma de estabilizados criopreservados fueron suministradas por institutos de investigaciones veterinarias de México, Argentina, Ecuador y Colombia. La cepa colombiana, aislada originalmente durante un brote de babesiosis, había sido atenuada por pasajes rápidos en becerros esplenectomizados y utilizada como vacuna (9). Todas las cepas habían sido mantenidas por transmisión en Boophillus microplus en condiciones de laboratorio y/o por pasaje mediante jeringa en animales esplenectomizados.

La cepa venezolana, aislada de un bovino portador en la Hacienda La Antonia, Edo. Yaracuy, se mantuvo congelada desde 1976 y pasada tres veces por bovino. Cada cepa se reactivó, separadamente, mediante inoculación en becerros esplenectomizados y la infección se midió mediante el examen de frotis coloreados por Giemsa, la determinación de la temperatura corporal y el hematocrito.

En cada caso se recolectó asépticamente sangre para cultivo in vitro (1% de parasitemia), preparación de estabilados (2-3% de parasitemia), elaboración de frotis-antígeno (5% de parasitemia como mínimo) para la prueba IFA y preparación de inoculo de confrontación (6 x 10⁸ organismos virulentos de B. bovis).

Producción de Exoantígenos

Las cepas se cultivaron de acuerdo con el método microaerófilo en fase estacionaria (MASP) descrito por Levy y Ristic (17): eritrocitos infectados (1% de parasitemia aproximadamente) se suspendieron (10% de concentración final) en una mezcla de medio 199 (60%), suero bovino normal (40%), Hepes (25 mM), estreptomicina (100 mg/ml) y penicilina (100 u.i./ml) y la suspensión, mantenida a un pH de 7,2, se incubó en un ambiente de CO^2, a 37°C y 95% de humedad. La parasitemia máxima promedio osciló entre 6 y 8% en un ciclo de cultivo de 72 horas.

El fluído sobrenadante, portador del exoantígeno se recolectó diariamente y fue procesado según técnica descrita por Kuttler et al. (15). Cada dosis vacunal consistía de 10 ml de fluído sobrenadante, concentrado por pervaporación o liofilización (10 ml-equivalentes), a la cual se le añadió 1,0 mg de adyuvante Seponina Quil-A (SupeFos DenMark).

Diseño Experimental

Veinte bovinos fueron divididos en dos grupos: 10 animales fueron vacunados con exoantígeno de cultivo de la cepa venezolana de B. bovis y 10 animales sirvieron como controles negativos. La vacuna se administró por vía subcutánea, en dos dosis de 1,0 ml cada una, en los días 0 y 21. Todos los animales, vacunados. y controles, divididos en sub-grupos (n = 4) fueron desafiados tres meses después de la segunda dosis vacunal, con 6 x 10⁸ organismos virulentos de B. bovis de las cepas de Venezuela, Ecuador, Argentina, Colombia y México.

Recolección y Análisis de Datos

A través de todo el experimento se determinaron los siguientes parámetros: temperatura corporal, hematocrito, número de plaquetas sanguíneas, parasitemia (en frotis delgados coloreados por Giemsa), título de anticuerpos específicos y valores de proteínas eritrofílicas plasmáticas. Los niveles de fibrinógeno y criofibrinógeno plasmático fueron determinados mediante pruebas de inmunodifusión radial y de precipitación en frío, respectivamente, de acuerdo con los métodos descritos por Goodger y Wright (10).

En los sueros de los bovinos vacunados se midieron los títulos de anticuerpos homólogos y heterólogos, según la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFA) descrita por James el al. (12). Se determinó además la ganancia neta de peso corporal post-desafío y los resultados se analizaron y compararon mediante la prueba estadística de significancia "t".

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La protección se midió sobre la base de las diferencias entre vacunados y controles, con respecto a: duración del período prepatente (tiempo requerido para visual izar los parásitos en frotis teñidos después de la inoculación), duración de la parasitemia, duración del período febríl, reducción del hematocrito, presencia de criofibrinógeno plasmático y ganancia neta de peso corporal.

En los Cuadros 1 y 2 se muestra la respuesta clínica y fisiopatológica en bovinos vacunados y controles frente al desafío con cepas virulentas de B. bovis de Venezuela, Ecuador, Argentina, Colombia y México. En el sub-grupo de bovinos desafiados con la cepa venezolana se observó una eficiente protección homóloga, notándose la ausencia de parasitemia en los animales vacunados, una disminución leve del hematocrito (20% de máxima reducción frente a 37% en los controles) y una muy corta reacción hipertérmica corporal (0,5 días de duración v s 3,5 días en los controles). Además, se observó una mejor ganancia de peso en los animales vacunados (37,5 kg vs 13,5 kg en los controles).

En este sub-grupo, la condición clínica de los animales vacunados permaneció prácticamente inalterada durante el período post-desafío, siendo significativa la diferencia entre vacunados y controles (< 0,05) (Cuadro 1 ).

Cuadro 1. Respuestas clínica y fisiopatologica¹en bovinos vacunados con exoantígeno de *B.bovis* (cepa Venezolana) y controles, después del desafío con cepas homólogas y heterólogas
Parámetros	Tipo de desafió
	HOMOLOGO		HETERÓLOGO
	Venezuela		Ecuador		Argentina
	Vac.	Cont.	Vac.	Cont.	Vac.	Cont.
Periodo prepatente (días)	0,0 + 0*	14,0 + 0	15,0 + 3,0	13,0 + 1,0	13,0 + 0*	10,0 + 2,0
Duración de parasitemia (días)	0,0 + 0*	2,0 + 0	2,0 + 0*	5,0 + 2,0	2,0 + 1,0	1,0 + 0
Duración de hipertermia (días)	0,5 + 0*	3,5 + 0	0,5 + 0,5	5,0 + 0	1,5 + 1,5	3,0 + 1,5
Reducción del Hipertemia (días)	20,0 + 1,0*	37,0 + 0,5	22,0 + 1,0*	35,0 + 2,0	25,0 + 1,0*	38,0 +1,0
Plaquetas (% máx.. de reducción)	51,0 + 3,0*	79,0 +3,0	71,0 + 4,0	79,0 + 5,0	59,0 + 3,0	79,0 +5,0
Criofibrionógeno²	-	+	-	+	+	+
Ganancia de peso corporal (Kg.)	37,5 + 0,5*	13,5 + 0,5*	45,5 + 2,5*	12,5 + 3,5	46,5 + 2,5*	14,0 + 5,0
¹Valores promedio + error standar ² Presencia de criofibrinógeno plasmático a °C ^*Diferencias significativas en relación con grupos controles (P<0,05)

El exoantígeno de la cepa B. bovis de Venezuela también mostró capacidad para inducir inmunidad heteróloga frente al desafío con las cepas de Ecuador y Argentina. En estos sub-grupos los animales vacunados mostraron una reducción máxima de hematocrito de 22% y 25% después del desafío con las cepas de Ecuador y Argentina, respectivamente, mientras que en los animales controles los valores correspondientes fueron de 35% y 38%. Aunque en estos animales se observaron parasitemias con duración entre 0,5 días (cepa ecuatoriana) y 1 ,5 (cepa argentina), la condición clínica permaneció inalterada, siendo significativa la diferencia entre vacunados y controles (P< 0,05).

La ganancia de peso en estos dos sub-grupos, mostró aumentos significativos en los animales vacunados, con valores promedios de 45,5 kg (cepa ecuatoriana) y 46,5 kg (cepa argentina), en comparación con valores de 12,55 kg y 14,0 kg de los respectivos grupos controles (P <0,05) (Cuadro 1 ).

El exoantígeno de B. bovis de Venezuela, sin embargo, no mostró efecto inmunoprotector frente al desafío con las cepas de Colombia y México. En los bovinos de estos dos sub-grupos se observó una deficiente protección, no constatándose diferencias significativas entre vacunados y controles al ser comparados los parámetros clínicos y fisiopatológicos después del desafío (Cuadro 2). Tanto vacunados como controles, después de la confrontación con las cepas de Colombia y México, fueron igualmente afectados con reducciones del hematocrito entre 35% (cepa colombiana) y 50% (cepa mexicana) en el grupo vacunado, en comparación con valores de 34% (cepa colombiana) y 51% (cepa mexicana) del grupo control. Igualmente, se constató la presencia de criofibrinógeno plasmático en bovinos desafiados con la cepa mexicana y una mayor duración del período febríl en todos los animales vacunados (4,0 a 6,0 días).

En la Figura 1 se comparan los títulos de anticuerpos IFA, homólogos y heterólogos, en los sueros de los bovinos vacunados con exoantígeno de cultivo de B. bovis, cepa venezolana. La máxima respuesta homóloga se alcanzó una semana después de la segunda dosis vacunal (título promedio = 1:2229) con niveles altos sostenidos durante un período de tres semanas, en tanto que los niveles de anticuerpos heterólogos resultaron inferiores, correspondiendo la mayor diferencia a la cepa mexicana.

En la Figura 2 se muestra la respuesta de anticuerpos IFA durante los períodos de vacunación y desafío. Los niveles de anticuerpos homólogos post-vacunales declinaron lentamente hasta un título pre-desafío de :160, alcanzado el día 109 post-vacunación. Después del desafío, se observó en los animales vacunados, una fuerte respuesta anamnéstica con título máximo de 1:327 650, aproximadamente cuatro semanas después de la confrontación en comparación con un título máximo de :9801 en los animales. controles.

Cuadro2. Respuesta clínica y fisiopatologica1 en bovinos vacunados con exoantígeno de B. bovis (cepas venezolanas) y controle, después del desafío con cepas homologas y heterólogas.
Parámetros	Tipo de desafió
	Homologo		heterólogo
	Venezuela		Colombia		México
	Vac.	Cont	Vac	Cont	Vac	Cont
Periodo prepatente (días)	0,0 + 0*	14,0 + 0	12,o + 0*	8,0 + 1,0	10,0 + 2,0	7,0 + 0
Duración de parasitemia (días)	0,0 + 0*	2,0 + 0	3,0 + 0	4,0 + 2,0	5,0 + 1,0	8,0 + 0
Duración de hipertermia (dias)	0,5 + 0,5	3,5 + 0	4,0 + 3,0	3,5 + 0,5	6,0 + 1,0	6,0 + 0
Reducción del hematocrito (% máx.)	20,0 + 1,0*	37,0 + 5,0	35,0 + 7,0	34,0 + 2,0	50,0 + 5,0	51,0 + 0
Plaquetas (% máx. de reducción)	51,7 + 3,0	79,0 + 3,0	62,6 + 6,0	80,0 + 5,0	73,5 + 5,0	83,0 + 3,0
Criofibrinógeno²	-	+	-	+	+	+
Ganancia de peso corporal (Kg)	37,5 + 0,5*	13,5 + 4,5	17,0 + 4,5	13.5 + 7,6	14,0 + 1,0	12,0 + 3,0
¹Valores promedios + error standar ² Presencia de criofibrinógeno plasmático a 4°C ^*Diferencias significativas en relación con grupos controles (P 0,05)


Figura1. Titulo promedio de anticuerpos IFA, homólogo y heterólogos, en bovinos vacunados con exoantígeno de B. bovis, cepas Venezolanas.	Figura 2. Títulos promedios de anticuerpos IFA, en bovinos vacunados con exoantígeno de B. bovis, cepas Venezolanas, y desafíos con organismos virulentos de cepas homologa (Venezuela) y heteróloga (Ecuador, Argentina, Colombia y México).

El incremento de la respuesta de anticuerpos frente al desafío heterólgo fue más gradual, con diferencias de hasta 10 diluciones entre títulos de anticuerpos homólogos y heterólogos, observados 10 días post-desafío. No obstante, en todas las cepas de B. bovis se alcanzaron eventualmente títulos altos de anticuerpos IFA.

La utilización de vacunas inactivadas constituiría un método sencillo, inocuo y de menor riesgo para la protección de los bovinos contra la babesiosis, enfermedad que en Venezuela representa un constante peligro, en particular para los animales de raza pura introducidos al país, con miras al mejoramiento de la productividad y producción de los rebaños nacionales. Los resultados obtenidos en bovinos vacunados con un exoantígeno derivado del cultivo in vitro de una cepa venezolana de B. bovis revelaron la inducción de una eficiente protección homóloga, lo cual confirmó informes previos de Smith et al. (29, 30) y Kuttler et al. (15, 16), quienes en ensayos realizados en México y E.U.A., respectivamente, constataron el desarrollo de protección homóloga frente a una cepa mexicana de B. bovis.

Igualmente, los resultados mostraron que la tecnología del cultivo in vitro es aplicable a otras cepas de B. bovis ya que la cepa mexicana, hasta la fecha, había sido la única cultivada y mantenida en estas condiciones (17).

El uso generalizado de inmunógenos de B. bovis está supeditado a su capacidad de protección cruzada, particularmente desde que se ha demostrado la existencia de diferencias antigénicas entre cepas (8). En este estudio se comprobó el fenómeno de variación antigénica, siendo los títulos IFA heterólogos invariablemente inferiores a los obtenidos en las reacciones homólogas.

Sin embargo, los resultados demostraron un buen grado de protección cruzada cuando bovinos vacunados con el exoantígeno de una cepa venezolana de B. bovis fueron desafiados con cepas virulentas de Ecuador y Argentina, lo cual indica la existencia de antígenos comunes protectivos entre cepas de diferentes regiones del continente. Por otra parte, no se observó protección significativa cuando bovinos vacunados con el exoantígeno venezolano fueron desafiados con cepas de B. bovis de Colombia y México.

Los bovinos controles, aunque enfermaron, no mostraron signos clínicos graves de babesiosis, mientras que los bovinos vacunados no mostraron en absoluto síntomas de la enfermedad, ganaron peso a través de todo el período post-desafío y las reacciones fisiopatológicas y parasitemias fueron transitorias. Observaciones similares a las señaladas han sido observadas durante ensayos de inmunidad cruzada con diferentes cepas australianas (4,13,22).

En la babesiosis bovina, la mayor parte de la fisiopatología está asociada a cambios profundos en el sistema regulador de la coagulación, observándose a menudo trombocitopenia, hiperfibrinogenemia y la formación de complejos criofibrinogénicos plasmáticos en animales afectados por la infección aguda (10). De allí que la protección podría medirse también sobre la base de la prevención del síndrome de "shock hipotensivo" característico de la infección aguda por B. bovis (11).

En este trabajo, la protección heteróloga, inducida por el exoantígeno soluble de B. bovis, fue capaz de evitar o aminorar los daños causados por estas reacciones fisiopatológicas. La ausencia de formación de criofibrinógeno en el plasma de los bovinos vacunados, después del desafío, se consideró como uno de los parámetros indicativos de la protección inducida contra la infección.

La vacunación con exoantígeno soluble proveniente del cultivo in vitro de B. bovis demostró que una protección adecuada puede inducirse contra la infección causada por cepas heterólogas de B. bovis. En este sentido, el inmunógeno de la cepa venezolana, pareció tener una muy buena capacidad de protección cruzada, lo cual contrasta con los resultado de TIMMS (31) que observó una protección heteróloga parcial, en bovinos vacunados con inmunógeno de cultivo de una cepa australiana.

La vacunación con exoantígenos de cultivo de la cepa B. bovis de Venezuela proporcionó protección contra las manifestaciones clínicas de la babesiosis; y se concluye que este método constituiría una forma más sencilla e inocua para la prevención de dicha enfermedad en los bovinos del país. No obstante, es necesario completar su evaluación como método profiláctico, mediante ensayos de campo en las condiciones enzoóticas y de exposición natural existentes en el país.

SUMMARY

The homologous and heterologous protective capacity of a B. bovis (Venezuelan strain) culture-derived exoantigen, in susceptible cattle, is reported. Susceptible mixed-Hoistein, yearling cattle were inoculated with B. bovis exoantigen and challenged with virulent B. bovis organisms of the Venezuelan, Ecuadorean, Argentinian, Colombian and Mexican strains. Exoantigen was given by subcutaneous route in two doses at three weeks intervals and the protection was assessed on the basis of the following physiopathological parameters: prepatent period, level and duration of parasitemia, duration of fever, packed cell volume (PCV) reduction, presence of cryofibrinogen, homologous and heterologous antibody levels, and net gain in body weight, after challenge exposure. Results showed a good degree of protection against B. bovis strains of Venezuela (homologous), Ecuador (heterologous) and Argentina (heterologous); whereas, a low degree of protection was observed in cattle challenged with the Colombian and Mexican B. bovis strains. It is conluded that the use of culture-derived exoantigens could be an inocuous and simpler immunoprophylactic method to protect cattle against babesiosis.

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