Veterinaria Tropical 14: 29-35. 1989

AISLAMIENTO DE Listeria monocytogenes EN BÚFALO (Bubalis bubalis) 

Aura Gallardo de López*, Yuraima Pineda de Mora* y Fanny Méndez de Aponte*

*FONAIAP
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias
Instituto de Investigaciones Veterinarias
Apto. 70 Maracay 2102 Venezuela

Recibido: octubre 06, 1989

 RESUMEN 

Una cepa de Listeria monocytogenes fue aislada en un búfalo (Bubalis bubalis) de seis meses de edad con diagnóstico clínico de listeriosis. El aislamiento se realizó de cerebro por enriquecimiento previo en caldo triptosa en frío y caldo triptosa adicionado de acriflavina y ácido nalidíxico, posterior- mente repicados a placas de agar sangre telurito y agar sangre fenil. La identificación de la cepa se basó en dos caracteres culturales, microscópicos y bioquímicos,..movilidad a temperatura ambiente y patogenicidad. Este reporte representa el primer aislamiento de L. monocytogenes de origen animal en Venezuela. 

INTRODUCCIÓN

La listeriosis es una zoonosis de etilogía bacteriana que afecta a los animales domésticos, silvestres y al hombre. El agente causal Listeria monocytogenes fue reportado por primera vez por Murray et al. ( 18) , en Inglaterra, como responsable de una septicemia epizootica en conejos y cobayos de laboratorio. 

En animales y humanos la listeriosis se presenta como una meningoencefalitis aguda que cursa con o sin septicemia, o bien en forma septicémica exclusivamente. Otras manifestaciones incluyen endocarditis, abortos, granulomatosis hepática y de otras vísceras, abscesos y lesiones cutaneas de tipo postular. Los grados de severidad de la enfermedad van desde la forma aguda y crónica hasta la de los portadores asintomáticos con eliminación del agente en heces, orina y exudados. Casi todos los animales domésticos son susceptibles a la enfermedad destacándose los ovinos y bovinos y luego caprinos, cerdos y aves. Ataca esporádicamente a los equinos y rara vez a caninos y felinos. En general, la principal manifestación clínica en animales domésticos es la encefalitis. 

L. monocytogenes tiene amplia distribución y resistencia en el medio ambiente lo cual contribuye a que la enfermedad se presente en el hombre y en varias especies animales ( 1, 3, 9) .Esta bacteria ha sido clasificada por homología del ADN y contiene por los menos 16 serovares (20). La especie L. monocytogenes es responsable de infecciones en el hombre y animales; L. ivanovii es patógena particularmente para ovinos; L. innocua, L. welshimeriy L. seeligeri son concideradas, apatógenas (22). 

En Venezuela se presume clínicamente la existencia de listeriosis, pero los indicios más precisos de la misma se señalan a partir de 1985, con el envío de muestras al Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP), correspondientes a un búfalo de un año de edad, procedente del estado Guárico, con diagnóstico presuntivo de esta enfermedad. Sin embargo, los intentos de aislamiento del agente causal para este caso fueron infructuosos. 

En este trabajo se informa sobre el primer aislamiento de L. monocytogenes, obtenido en 1988, én un búfalo con diagnóstico clínico de listeriosis. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Procedente del estado Táchira se recibió en el Instituto de Investigaciones Veterinarias un búfalo de seis meses de edad, que presentó un cuadro de incoordinación, letargo, movimientos circulares y postración decubito lateral, lo cual fue asociado con listeriosis. Las muestras procesadas incluyeron cerebro, médula espinal, líquido céfalo-raquideo, ganglios linfáticos, corazón, pulmón, bazo, hígado, intestino, sangre y orina. La bacteriología de rutina se aplicó para el examen de estos especímenes y la metodología especial para el aislamiento de L. monocytogenes fue practicada en cerebro, médula espinal, líquido céfalo-raquideo y ganglios linfáticos como a continuación se describe.

Examen Bacteriológico. 

Cultivo y aislamiento: segmentos de cerebro, médula espinal y ganglios linfáticos se procesaron de acuerdo con lo recomendado por Cottral (4). Luego de triturados y suspendidos en caldo triptosa se procedió a la siembra de los siguientes medios: a) placas de agar sangre adicionadas de telurito de potasio al 0,05% y agar sangre fenil (DIFCO) y luego incubadas a 37°C, por 48-72 horas y observadas hasta por cinco días; b) caldos de enriquecimiento: segmentos de cerebro, médula y ganglios linfáticos se inocularon, por separado, en 40 mi de caldo triptosa (DIFCO), conservados a 4°, con repiques semanales hasta por dos meses (4), y en 40 m I de caldo triptosa adicionado de acriflavina (10 mcg/ml) y ácido nalidíxico (40 mcg/ml) y mantenidos a temperatura ambiente por cinco días de acuerdo con Hofer (13). Los repiques de ambos caldos de enriquecimiento fueron realizados a los medios en placas ya mencionados e incubados por igual tiempo y temperatura.

El líquido céfalo-raquideo se procesó del sedimento obtenido previa centrifugación, sembrándolo en los medios de agar sangre-telurito de potasio y agar sangre-fenil. 

Identificación. 

La identificación se hizo basada en: a) caracteres culturales; b) examen microscópico y movilidad a temperatura ambiente ya 37°C usando el medio de SIM; c) caracterización bioquímica preliminar, basada en pruebas de catalasa, hidrólisis de la esculina, producción de hidrógeno sulfurado (H2S) en el medio de Kligler y fermentación de glucosa, manitol y salicina a fin de establecer el diagnóstico diferencial con los géneros Corynebacterium, Erysipelothrix y Lactobacilltls, según Koneman et al. (17). 

El resto de caracteres bioquímicos determinados incluyó pruebas de hidrólisis de la urea, gelatina y reducción de nitratos, Voges Proskauer y fermentación de otros carbohidratos como arabinosa, galactosa, glicógeno, lactosa, melibiosa, melizitosa, ramnosa, sacarosa, sorbitol, salicina y xilosa de acuerdo con el Manual Bergey ,(22). 

Patogenicidad. 

El aislamiento se evaluó por dos métodos para determinar su patogenicidad, siguiendo lo recomendado por otros autores (2): a) Test de Anton, por instilación de 1 gota de un cultivo en caldo triptosa de 24 h de incubación, en el saco conjuntival de un conejo y cobayo, permaneciendo el saco conjuntival del ojo opuesto como control negativo. La prueba se consideró positiva al producirse una querato-conjuntivitis; b) patogenicidad en ratones, por inoculación, vía subcutánea, de 12 ratones con 0,5 m I c/u de un cultivo en caldo triptosa de 24 h de incubación. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Examen Bacteriológico. 

Del examen bacteriológico de rutina practicado en las diferentes muestras no se obtuvieron aislamientos de significación. Las siembras directas realizadas a partir de cerebro, médula espinal, líquido céfalo-raquideo y ganglios linfáticos en los medios de agar-sangre-telurito y agar-sangre-fenil no revelaron cultivos sospechosos de L. monocytogenes. Sin embargo, el primer repique realizado a partir de los enriquecimientos tan- to del caldo triptosa en frío como del adicionado con acriflavina y ácido nalidíxico, permitió el desarrollo en agar sangre telurito y agar sangre fenil de colonias pequeñas, bordes lisos, traslúcidas, grisaceas y beta hemolíticas que correspondieron a bacilos Gram. positivos, cortos y aislados o dispuestos en pares, sin esporas y aeróbicos. El estudio de la movilidad resultó positivo para los cultivos mantenidos a temperatura ambiente con la forma típica de sombrilla descrita en la literatura. Esta prueba resultó negativa con los cultivos incubados a 37°C.

La caracterización bioquímica preliminar reveló positividad para las pruebas de catalasa, hidrólisis de la esculina y fermentación de la glucosa y salicina y resultados negativos para la producción de H₂S y fermentación del manitol, lo cual permite excluir a los géneros Corynebacterium, Erysipelothrix y Lactobacillus. Los resultados de las características bioquímicas restantes se presentan en el Cuadro 1.

Los resultados obtenidos mediante caracteres culturales, microscópicos, bioquímicos y de patogenicidad permitieron el diagnóstico de L. monocytogenes. Es importante señalar que cuando existe el diagnóstico presuntivo de listeriosis debe verificarse la patogenicidad del aislamiento asociado. Se ha señalado que el carácter patógeno de las listerias se correlaciona con la hemólisis (11, 23, 24), considerándose virtualmente que todas las cepas patógenas de L. monocytogenes producen hemólisis del tipo beta (19, 23). La hemolisina denominada listeriolisina es una proteína con PM de 170000 (14) que lesiona a los fagocitos y lisosomas (15) y posee efectos cardiotóxicos (16), lo que representa factores relevantes de patogenicidad. Sin embargo, la hemólisis puede presentarse en forma débil siendo obligatoria la inoculación en animales para confirmar la patogenicidad de los aislamientos.

Aun cuando la cepa hallada en este trabajo produjo hemólisis beta, su patogenicidad fue confirmada por la producción de queratoconjuntivitis en conejo y cobayo la cual se evidenció a partir de los tres días post-inoculación. Simultáneamente también se detectó mortalidad en el1 00% de los ratones inoculados. Debe también considerarse que los aislamientos de L. monocytogenes, en medios convencionales, a menudo pueden fallar, pero el aislamiento es exitoso cuando las muestras se enriquecen en frío. De aquí la recomendación de que una porción del material se conserve a 4°C y se recultive periódicamente por dos a tres meses si el intento inicial falla. 

La presentación clínica de la enfermedad es esporádica pero su importancia radica en la existencia de portadores y el rol que desempeñan desde el punto de vista epidemiológico, ya que estos eliminan el microorganismo tan- to en forma continua como intermitente sin mostrar signos clínicos (1, 7, 8, 10). Como zoonosis, este aspecto tiene una significación considerable en salud pública, especialmente el personal de campo corre un riesgo importante por el contacto directo que mantienen con animales portadores y enfermos. 

Recientemente han sido señalados brotes de listeriosis en humanos (5, 21) lo que ha incrementado el interés por la detección de L. monocytogenes en alimentos, en especímenes biológicos y en el ambiente. La leche se ha señalado como vehículo de transmisión de la listeriosis (7) y en efecto Fleming et al. (5) informaron sobre un brote de listeriosis humana, con mortalidad del 31 ,8%, asociado con el consumo de leche pasteurizada; el producto implicado en dicho brote provino de fincas en las cuales la listeriosis había ocurrido al momento en el cual la enfermedad fue diagnosticada en huma- nos. Otros autores también han demostrado la presencia de L. monocytogenes en leche cruda (6, 12). 

La información aquí reseñada revela la existencia de la listeriosis en el área veterinaria, confirmada por el primer aislamiento de L. monocytogenes, lo cual a su vez constituye un alerta debido al carácter zoonotico de dicha enfermedad. 

SUMMARY

A Listeria monocytogenes strain was isolated in a s ix months old buffalo (Bubalis bubalis) with clinical diagnostic of listeric infection. The isolation was done from brain by previous cold enrichment in tryptose broth as well as in tryptose broth supplemented with acriflavine and nalidixic acid following inoculation to tellurite and fenil blood agar plates. The strain was identified by means of cultural, microscopic and biochemical characters, optimal motility at room temperatura and pathogenic tests. This report showed the first isola- tion of L. monocytogenes from animal source in Venezuela.

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