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Veterinaria Tropical. 15: 77-86. 1990 EVIDENCIA SEROLÓGICA DE LA DIARREA VIRAL BOVINA EN VENEZUELA B. Larsson* y C. Obando** *Department
of Cattle and sheep diseases, Swedish University of Agricultural |
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RESUMEN Se investigó la presencia de anticuerpos seroneutralizantes contra el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) , en 18 sueros de bovinos nativos, no vacunados contra este virus, procedentes de seis fincas, y 27 sueros de bovinos importados, procedentes de una finca. Todos los sueros fueron recolectados durante el año 1983. De los 18 bovinos nativos, 6 resultaron seropositivos, con títulos que variaron desde 1:4 hasta 1 ³ 4. 096. En el rebaño importado, 26 de los 27 animales resultaron con anticuerpos contra el VDVB, con títulos que variaron desde 1 :128 hasta 1 ³ 4.096. Mediante la técnica de ELISA indirecta se determinó la presencia de anticuerpos contra el VDVB en muestras de leche, obtenidas de tanques de 32 fincas lecheras con ganado nativo, no vacunado contra este virus, y 41 fincas con ganado importado. Se demostró que el 81% de las fincas con ganado nativo y el 98% de las fincas con ganado importado, tenían anticuerpos contra el virus. Estos resultados constituyen la primera evidencia serológica de que el virus de la diarrea viral bovina se encuentra en Venezuela. INTRODUCCIÓN La infección primaria con el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es a menudo subclínica, pero puede causar diarrea y enfermedad respiratoria entre bovinos adultos y terneros. Se cree que esta infección reduce los mecanismos de defensa del huésped y en consecuencia incrementa la severidad de las enfermedades causadas por otros agentes patógenos. Además, la infección transplacentaria con el VDVB puede conducir a abortos, defectos teratogénicos o al nacimiento de becerros infectados persistentemente, los cuales debido a la inmunotolerancia son usualmente seronegativos (15). Estos animales continuamente excretan el virus y constituyen la población de alto riesgo para desarrollar la condición fatal conocida como enfermedad mucosal (5, 13). Siguiendo a la infección primaria con el VDVB, el huésped desarrolla su inmunidad la cual se considera de por vida. Estudios serológicos mediante la técnica de seroneutralización han revelado la amplia distribución de esta enfermedad. Blood et al. (2), en una encuesta llevada a cabo en Europa (Inglaterra y Alemania), África (Kenya y Zimbawe) y Australia, señalan una prevalencia de serorreactores entre 40 y 90%. Bolin et al. (4), encontraron una prevalencia en los Estados Unidos de América de 89%, sobre 66 rebaños encuestados. En México, 70,5% de los bovinos de leche y 62,5% de los bovinos de carne, resultaron seropositivos a este virus (14). En Colombia Griffiths et al. (6) detectaron 47% de seropositivos sobre una muestra de 4.105 bovinos, no pudiéndose descartar la posibilidad de que algunos animales tuvieran títulos post-vacunales. La observación en Venezuela de bovinos con signos clínicos compatibles con la diarrea viral bovina (DVB), desde la década de los setenta, permite presumir en que el virus responsable de esta enfermedad ha estado infectando algunos rebaños. En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue confirmar, mediante pruebas de serología, si ha ocurrido infección por este virus en bovinos del país.
MATERIALES Y MÉTODOS Este trabajo se fundamentó en la detección de anticuerpos contra el VDVB, a partir de muestras de leche y suero procedentes de fincas con ganado nativo no vacunado, comparando los resultados con los obtenidos en fincas con animales importados. Detección de anticuerpos en leche. Las muestras de leche, en volúmenes de 8 a 10 ml, fueron obtenidas a partir de tanques o de cántaras, éstas últimas en aquellas fincas en las cuales no había equipo de refrigeración. Se colectaron muestras de 73 fincas ubicadas en los estados Zulia, Mérida, Falcón y Guárico. De estas fincas, 32 estaban constituidas exclusivamente por ganado nativo no vacunado y en 41 habían realizado importación de animales. Las muestras se mantuvieron conservadas con hielo por 2- 4 días hasta su traslado al laboratorio, donde fueron centrifugados para sedimentar los detritos celulares y separar la capa de grasa sobrenadante. La fracción intermedia se conservó a -20°C hasta su procesamiento. Determinación de anticuerpos mediante la técnica enzimo inmuno ensayo (ELISA). La técnica de ELISA indirecta utilizada para la detección de anticuerpos contra el virus de la DVB ha sido descrita anteriormente en detalle (8, 12). En resumen, placas de microtécnica marca Nunc fueron utilizadas para fijar el virus de la DVB solubilizado en detergente, las mismas se almacenaron a 4°C hasta el análisis. Para comenzar, las placas fueron lavadas dos veces con solución salina buferada conteniendo 0;05% de Tween 20 (PBS-T). Las muestras de leche desgrasada, no diluida, se agregaron en volumenes de 100 m l por celdilla, en duplicado. Después de un período de incubación de 1 hora a 37°C, se lavaron las placas dos veces con PBS- T y se añadió anticuerpo monoclonal anti inmunoglobulina bovina conjugada con peroxidasa de rabano picante, en dilución 1 :40 000, en cantidades de 100 m l por celdilla. Se incubaron a 37°C por 1 hora y luego se lavaron nuevamente dos veces con PBS-T y se añadió solución sustrato (0,1 mg tetrametilbenzidina/ml, 0,1 M de acetato de sodio, pH 6,0, y 0,05% de H2O2), 100 m l por celdilla. Después de 10 minutos a temperatura ambiente se frenó la reacción con 25 m l de 2M H2SO4. La intensidad del color amarillo generado fue comparada visualmente con el de las muestras positivas y negativas control traídas de Suecia. Los resultados se consideraron como negativos (-), débilmente positivos (+), positivos (++) o fuertemente positivos (+++), de acuerdo con el siguiente criterio:
Detección de anticuerpos en suero. Para la detección de anticuerpos en suero se analizaron muestras de bovinos que habían sido sangrados durante el año 1983, 18 pertenecían a seis fincas con ganado nativo, no vacunado contra la DVB, tres de ellas ubicadas en el estado Portuguesa, dos en el estado Lara y una en el estado Yaracuy. Así como también sueros de 27 bovinos importados, pertenecientes a una finca ubicada también en el estado Portuguesa. Todos estos sueros se encontraban conservados a -20°C. Detección de anticuerpos neutralizantes. Para detectar en los sueros la presencia y el título de anticuerpos neutralizantes contra el VDVB, se realizó la prueba de seroneutralización descrita por Bock et al. (3), pero con algunas modificaciones. En placas de microtécnica FALCÓN 3.040 se hicieron diluciones dobles de los sueros desde 1:4 hasta 1:4096. A cada dilución se le agregó 100 dosis infecciosas en cultivo celular 50 (DICC-50) de la cepa NADL de referencia, suministrada por el National Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa; seguidamente se dejaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora. Transcurrido el tiempo de neutralización, se adicionó la línea celular Bovine Turbinate en suspensión con 5 x 105 cel/ml y se incubaron en estufa de CO2 a 37°C durante siete días. Los volúmenes se ajustaron a 50 m l para diluciones de suero, antígeno y suspensión celular. En la pruba se incluyeron sueros positivos y negativos de referencia, así como control de los sueros, unidades vírales y células. Al mismo tiempo se realizó titulación simultánea del antígeno, a fin de comprobar el número de DICC-50, utilizada en la prueba.
RESULTADOS Detección de anticuerpos en leche. Los resultados de los análisis de las muestras de leche se presentan en el Cuadro 1; de las 73 fincas muestreadas, 66 (90%) evidenciaron anticuerpos contra el virus de la diarrea viral bovina, y de ellas, 26 fueron consideradas fuertemente positivas. De las 32 fincas con ganado nativo, no vacunado, 26 (81 %) resultaron con anticuerpos contra el VDVB. Detecci6n de anticuerpos en suero. Como resultado de las pruebas serológicas realizadas en las fincas con ganado nativo, no vacunado, se detectó que en las fincas D y E, en las cuales se analizaron dos sueros de bovinos, ninguno tenía anticuerpos contra el VDVB. No así en las fincas A, B, C y F en las cuales 6 de los 16 bovinos encuestados resultaron seropositivos, con títulos que variaron desde 1 :4 hasta 1³ 4.096 (Cuadro 2).
De manera diferente, en la finca con ganado importado (G) se detectó que 26 de los 27 bovinos probados (96,2%), tenían anticuerpos seroneutralizantes contra el VDVB, con títulos que variaron desde 1 :128 hasta 1: ³ 4096. Un solo animal resultó seronegativo (Cuadro 2). DISCUSIÓN Este trabajo constituye una evidencia serológica de que ha habido infección por el VDVB en algunos rebaños de Venezuela. Las pruebas serológicas evidenciaron, en ganado nativo no vacunado, 6 animales con altos niveles de anticuerpos neutralizantes (Cuadro 2), lo cual es muy poco probable que se origine en respuesta a una infección por el virus del cólera porcina. Este virus está antigénicamente relacionado con el virus de la DVB (7), y al igual que el de la DVB, pertenece al género Pestivirus, familia Togaviridae (16). La infección con el virus del cólera porcina ocurre en Venezuela entre cerdos, pero las muestras probadas correspondieron a fincas de ganado lechero en las cuales los animales no han tenido contacto con cerdos. Por otra parte, 12 bovinos (67%) no presentaron anticuerpos neutralizantes, lo cual pudo obedecer a que no habían tenido contacto con el virus, sin descartar la posibilidad de que algunos pudieran haber sido bovinos inmunotolerantes, ya que estos animales generalmente no desarrollan anticuerpos contra el VDVB y en caso contrario en niveles bastante bajos (10). En la finca de ganado importado, se detectó por seroneutralización que el 96,2% de los bovinos tenían anticuerpos contra el VDVB, con títulos que variaron desde 1 :128 hasta 1:³4096 lo cual fue indicativo que dichos animales estaban inmunes contra este virus, a diferencia del bovino seronegativo, el cual muy probablemente, era un animal inmunotolerante e infectado persistentemente. McClurkin y Coria (10) señalan que títulos seroneutralizantes iguales o mayores a 1 :32, en las hembras gestantes, protegen al feto de una infección por el VDVB, impidiendo en consecuencia que nazcan animales con efectos causados por el virus. En un animal seropositivo los niveles de anticuerpos en leche son comúnmente más bajos que en el suero; sin embargo, durante la lactancia se encuentran en suficiente cantidad e indican en forma aproximada el nivel de anticuerpos humorales en la vaca (12), es por ello que muestras de leche de tanque pueden ser utilizadas para dilucidar el estado inmunitario de un rebaño. Muestras de leche negativas, obtenidas de tanque o de cántaras, indican que ninguna o muy bajo porcentaje de las vacas en ordeño presentan anticuerpos contra el virus, mientras que muestras fuertemente positivas indican una prevalencia de serorreactores cercana al 100% (*). En este estudio la lectura de las reacciones de la ELISA indirecta se realizó visualmente, por lo que no puede ser excluido que algunos de los resultados pudieran haber sido mal interpretados, permitiendo una sobre o subestimación en el número de fincas con anticuerpos, especialmente en aquellas con resultados negativos o débilmente positivos. Sin embargo, el alto porcerntaje de fincas con ganado nativo no vacunado (81%), que resultaron con anticuerpos contra el VDVB, 5 (19%) de ellas con reacciones fuertemente positivas, son una prueba de difusión del virus en tos estados que se muestrearon (Cuadro 1). Debido al escaso número de muestras examinadas, no se puede estimar la verdadera prevalencia de animales seropositivos o fincas con animales seropositivos, por alto se recomienda continuar con estos estudios, a objeto de conocer la situación de la DVB en Venezuela, requisito para poder establecer la estrategia de control. Agradecimiento Los autores agradecen al Instituto Nacional Veterinario de Upsala, Suecia, por la preparación y donación de los reactivos utilizados en las pruebas de ELISA, así como también a los médicos veterinarios Jesús Morales, Salin Mora y Carlos Pedrique, por su colaboración en la recolección de las muestras. SUMMARY The presence of serum-neutralizing antibodies to bovine virus diarrhea virus (BVDV) was tested in 18 sera from native Venezuelan cattle in 6 herds and in 27 sera from one farm with imported cattle.The animals weresampled during 1983. Six of sera from the native cattle were found to be seropositive to BVDV with titres ranging from 1 :4 to 1: ³4096; 26 of the 27 sera from the imported cattle were antibody positive with titres ranging from 1 :128 to 1:³4096. An indirect ELISA was used to examine the presence of BVDV antibodies in bulk milk from 32 dairy herds with only native cattle and in bulk milk from41 herds with imported cattle. The results show that 81% of thesamples from the herds with native cattle and 98% of the samples from the herds with imported cattle were positive for BVDV antibodies.This is thefirst report giving serological evidence for the presence of BVDV in Venezuela. BIBLIOGRAFÍA 1. BAKER, J. C. Bovine viral diarrhea virus: A revies. J. Am. Vet. Med. Assoc. 190: 1 449-1 458. 1987. 2. BLOOD. D. L., J. A. HENDERSON and O. M. RADOSTITIS. Medicina Veterinaria. 6ta edición. Nueva Editorial Interamericana. 1986. p. 825-834. 3. BOCK, R. E.. G. W. BURGESS and C. DOUGLAS. Development of an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of bovine serum antibody to bovine viral diarrhea virus. Aust. Vet. J. 63: 406-408. 1986. 4. BOLIN, S. R.. A. W. McCLURKIN and M. F. CORIA. Frequencyof persistent bovine viral diarrhea virus infection in selected cattle herds. Am. J. Vet. Res. 46: 2 385-2 387. 1985. 5. BROWNLIE. J.. M. C. CLARKE and C. J. HOWARD. 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