Veterinaria Tropical. 15: 87-98. 1990

PRODUCCIÓN DE COLICINAS, HEMOLISINAS y RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS EN CEPAS DE Escherichia coli DE CERDOS CON DIARREA 

Y. Pineda de Mora* y V. Rodríguez Lemoine** 

* FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
 Instituto de Investigaciones Veterinarias. Aptdo. 70. Maracay 2101. Venezuela.
** Universidad Central de Venezuela. Centro de Biología: Celular.
Facultad de Ciencias. Caracas 1020. Venezuela.

RESUMEN 

Un determinado número de cepas de E. coli provenientes de suinos con diarrea, cuyas edades oscilaron entre 1 y 5 semanas, fueron analizadas en su capacidad de producir colicinas, hemolisinas y resistencia frente a 14 agentes antimicrobianos. Cinco (21 %) de las 24 cepas de E. coli analizadas para producción de colicinas fueron colicinogénicas y cuatro (7%) de 61 cepas probadas para producción de hemolisis fueron hemolíticas. El 100% de las cepas colicinogénicas y hemolíticas mostraron resistencia múltiple a los antimicrobianos. Todas las cepas analizadas fueron resistentes a neomicina (Nm), estreptomicina (Sm), tetraciclina (Tc) y Triple sulfa (Ts). Se observó resistencia al menos a seis y máximo a once antimicrobianos. Los antimicrobianos con más baja frecuencia de resistencia fueron gentamicina (Gm), cefalotina (Cf) y colistina (CI). Ninguna de las cepas fueron resistentes a polimixina B (PB) y ácido nalidíxico (AN). Una alta proporción de los determinantes de resistencia estuvo ligada a plásmidos transmisibles, por el contrario no se observó transferencia de los caracteres colicinogénicos y hemolíticos. 

INTRODUCCIÓN 

Escheríchía colí enteropatógena es el agente bacteriano más incriminado en la aparición de diarrea secretaria en suinas durante las primeras semanas de vida. La capacidad de desencadenar este proceso se debe a la habilidad de estas cepas de colonizar el intestino delgado de los individuos y producir enterotoxinas que determinan el aumento de la secreción intestinal (12, 16). 

Existen otras características que son frecuentemente observadas en cepas de E. coli enteropatógena, como son producción de colicinas (10, 26), hemolisinas (5, 15) y resistencia a los antimicrobianos (13, 17, 28, 29).

 Se ha relacionado la producción de colicinas, especialmente col V, y de hemolisinas con cepas de E. coli que tienen la capacidad de causar infecciones extraintestinales generalizadas en el hombre y los animales. Aunque no está claro si la presencia de estos fenotipos contribuye directamente a la virulencia de estas cepas invasivas. Sin embargo, estos fenotipos son frecuentemente observados en cepas de E. coli enteropatógena causante de diarrea; se asume que probablemente su efecto pueda estar ligado a una determinada propiedad de virulencia de la bacteria. Se ha demostrado que los plásmidos (Col) confieren a E. coli una gran habilidad para sobrevivir en la sangre, fluido peritoneal y tracto intestinal de humanos y animales razón por lo que se han relacionado ampliamente con patogenicidad (7). 

Las colicinas son proteínas bactericidas (bacteriocinas) producidas como un factor de virulencia por ciertas cepas de E. coli. Existen investigadores que evidencian la relación entre colicigenicidad y patogenicidad (10, 23, 25, 27). Se ha observado la producción de colicinas por cepas de E. coli de clásicos serogrupos, aisladas de cerdos con colibacilosis, donde e1 60% fueron colicinogénicas en contraste con 17% colicinogénicas aisladas en cerdos sin diarrea (25). Otro estudio reveló más del 80% de cepas E. Coli enteropatógenas, de origen porcino, eran colicinogénicas y sólo el 25% no enteropatógenas probadas, fueron colicinógenas (10). 

Las hemolisinas producidas por cepas de E. coli son proteínas tóxicas extracelulares (exotoxinas) que rompen la membrana de los eritrocitos y de otras células eucarióticas, frecuentemente producidas por cepas de determinadas especies bacterianas pat6genas para humanos y animales (9, 15). Aunque se ha llegado a relacionar con patogenicidad, la función precisa que juegan las hemolisinas en la patogénesis es desconocida, y más aún, se considera como una característica inespecífica por considerar que también puede ser causada por proteínas extracelulares diferentes y no relacionadas, o por otros compuestos que actúan sobre los eritrocitos (2.).

Existen evidencias claras que demuestran la relación de las hemolisinas con patogenicidad en bacterias gram positivas, pero en gram negativas su significado es aún controversial; en el caso de E. coli, un pequeño porcentaje de cepas aisladas del intestino de individuos sanos y con diarrea son hemolíticas, aunque cepas de E. coli hemolíticas frecuentemente están presentes en infecciones extraintestinales.

Existen numerosas investigaciones que informan sobre la multirresistencia en cepas de E. coli enteropatógenas de origen humano y animal. Esta característica determina una dificultad para el control de este agente infeccioso (17, 20, 28, 29).

Se ha demostrado que la información genética de todas las características mencionadas está codificada en plásmidos (Col, Hly, A) diferentes e independientes (5,11, 24). Ha sido demostrado que  la producción de hemolisinas en cepas de E. coli, productor de infecciones extraintestinales, está codificada cromosómicamente, y el determinante Hly cromosomal tiene una complejidad genética similar al determinante Hly plasmídico. La condición plasmídica les confiere cierta ventaja selectiva para que estas características prevalezcan en este tipo de cepas. 

El objetivo del presente trabajo fue hacer un estudio de la producción de colicinas, hemolisinas y resistencia a los antimicrobianos en un determinado número de cepas de E. coli, aisladas de cerdos con diarrea, y reconocer con qué frecuencia estas propiedades se presentan simultáneamente y si ellas pudieran estar siendo cotransferidas en las cepas analizadas.

MATERIALES Y MÉTODOS 

Cepas bacterianas

Las cepas de E. coli analizadas fueron aisladas del intestino delgado de cerditos con diarrea y se caracterizaron siguiendo la metodología descrita por Edwards y Ewing (6). La edad de los animales estuvo entre 1 y 5 semanas. Estas cepas eran porta adoras del fenotipo lactosa positiva y sensibles al ácido nalidíxico (Lac+ Nals). Se analizaron 24 cepas para producción de colicinas y 61 para producción de hemolisinas; todas las cepas se probaron para conocer su susceptibilidad frente a 14 antimicrobianos. 

Las cepas de E. coli  y sus transconjugantes fueron analizadas en cuanto a la producción de colicinas, hemolisinas y susceptibilidad frente a 14 antimicrobianos.

Detección de colicinas

Para la detección de colicinas se utilizó la técnica de la doble capa, inicialmente desarrollada por Fredericg (8). 

Las cepas de E. coli se sembraron en caldo LB (19) a 37°C durante 24 horas. Estos cultivos se sembraron luego por punción en agar Lb 1,6%. Después de crecerlas toda la noche a 37°C, las colonias desarrolladas en cada placa se sacrificaron por exposición a vapores de cloroformo (CH CI3)durante 10 minutos y luego las placas fueron cubiertas con 3 ml de agar blando fundido (18), previamente inoculado con 0,1 ml de un cultivo fresco de la cepa indicadora E. coli K12 C600 sensible a las colicinas, las placas se reincubaron a 37°C por 24 horas; en cada placa se sembró una cepa control colicinogénica (R2-1) y una cepa control no colicinogénica (J5 477 Nal).

La producción de colicinas fue puesta en evidencia por la formación de halos de inhibición del crecimiento expresado en milímetros. Las cepas que inhibieron el crecimiento de E. coli K12 C600 se consideraban productoras de colicinas.

Detecci6n de hemolisinas

Se realizó por observación de la acción lítica de las cepas en placas de agar sangre de conejo, después de 24 horas de incubación a 37°C.

 Susceptibilidad a los antimicrobianos

La susceptibilidad a 14 agentes antimicrobianos se realizó según la metodología descrita por Bauer et al. (1). Los antimicrobianos utilizados fueron ácido nalidíxico (AN); ampicilina (Am); cefalotina (Cf); colistina (CI); cloranfenicol (Cn); gentamicina (Gm); kanamicina (Km); neomicina (Nm); nitrofurantoina (Nf); polimixina B (PB); estreptomicina (Sm); tetraciclina (Tc); trimetoprin-sulfametoxazole (Tsx) y triple sulfa (Ts). 

Experimentos de conjugación

Estas pruebas se realizaron según metodología descrita por Rodríguez Lemoine y RoWbury (18). Se utilizó como donantes las cepas de E .coli salvajes (lac+, Na18) y como receptora una cepa de E. coli K12y 711 (lac-yNal'). La conjugación se realizó a 30°C por 2 horas, y la selección de transconjugantes se realizó en placas de Agar Medio Mínimo (4) suplementado con los requerimientos nutricionales de la receptora, adicionado de ácido nalidíxico (40 g/ml) y el antimicrobiano por cuyo determinante se va a seleccionar (Am, Cn, Km, Sm yTc). Las transconjugantes  fueron aisladas por agotamiento en ausencia de presión selectiva y posteriormente se determinó el fenotipo de los plásmidos transferidos (Col, Hly y R). 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El 21% de un total de 24 cepas analizadas para producción de colicinas fueron colicinogénicas (Cuadro 1) y exhibieron resistencia múltiple a los antimicrobianos (Cuadros 2 y 3). Todas estas cepas fueron resistentes a kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina y triple sulfa (Cuadro 3). La máxima resistencia de estas cepas fue a 11 antimicrobianos y mínimo a 6. Ninguna de las cepas fue resistente a Polimixina B (Cuadro 2). Estos hallazgos cciden con lo señalado por Harnett y Gyles (10), en cuanto a la frecuencia de producción de colicinas y susceptibilidad a los antimicrobianos en cepas de E. coli asociada a diarrea en porcinos. 

La producción de hemolisinas se observó en e1 7% de un total de 61 cepas estudiadas (Cuadro 1). El 100% de ellas exhibieron resistencia múltiple a los antimicrobianos. Todas fueron resistentes a neomicina, estreptomicina, tetraciclina y triple sulfa, se le observó resistencia máxima a 9 antimicrobianos y mínimo a 6. Ninguna de las cepas fueron resistentes a colistina, gentamicina y polimixina B (Cuadros 2 y 3).

 Las cepas de E. coli causante de diarrea en cerdos codifican una serie de propiedades gen éticas especiales que favorecen su permanencia en el intestino, entre las cuales las de mayor importancia son adherencia y toxigenicidad (12, 16, 24). Sin embargo, se hadado particular interés a otras propiedades observadas en E. coli enteropatógena como son colicinogenia, hemólisis y resistencia múltiple a los antimicrobianos (5, 13, 25, 26). 

La colicinogenia es una propiedad más común entre cepas de E. coli enteropatógena que entre no enteropatógenas de origen porcino (10, estando esta propiedad asociada con patogenicidad y con una mejor sobrevivencia de la bacteria en el tracto intestinal, más aún cuando se sabe que esta propiedad es codificada por plásmidos (23, 25). La frecuencia de producción de colicinas en estas cepas fue significativa lo que conjuntamente con la alta frecuencia de resistencia determinan la prevalencia de un E. coli que puede persistir en el ambiente por el uso difundido de los antimicrobianos en la industria porcina. 

En cuanto a la producción de hemolisinas, ésta se considera baja, probablemente no relacionada con patogenicidad, si se toma en cuenta los datos reportados por Cooke (3) y Smith (22), quienes coinciden en dar un estimado de incidencia de E. coli hemolítico en las heces de individuos normales de 8 a 18%, señalando un pequeño porcentaje de E. coli hemolítico en individuos con diarrea; sin embargo, se ha reportado que E. coli hemolítico puede incrementar su virulencia en ratones, por inoculación intraperitoneal, pero este efecto depende sólo del tipo de plásmido Hly presente y no parece estar directamente relacionado con la actividad hemolítica propiamente (24). 

El 43% de las 61 cepas analizadas para determinar su susceptibilidad frente a 14 agentes antimicrobianos  fueron capaces de transferir esta condición a cepas E. coli  K12 (Cuadro 4), lo cual indica la presencia en estas cepas de un alto porcentaje de plásmidos R conjugativos. Esto coincide con numerosos reportes sobre la amplia diseminación de la resistencia a nivel mundial en la cría porcina (14, 17, 28, 29). En este estudio no   se  observó la  transmisibilidad de los plásmidos Col y Hly. Aunque hay informes que evidencian la naturaleza transmisible de estos plásmidos, en este caso los plásmidos que codifican esta características no son auto transmisibles y son independientes de los que codificaron resistencia, lo cual coincide en parte con lo señalado por Silva et al. (21).

Este estudio deja en evidencia que la resistencia, por su naturaleza transmisible, es prevalente y elevada en cepas de E. coli productoras de colicinas y hemolisinas, facilitando su presencia en el ambiente la presión selectiva ejercida por el antimicrobiano; a la vez se demuestra la no cotransferencia de los caracteres Col, Hly y R en las cepas analizadas. 

SUMMARY 

A study was carried out related to colicinogeny hemolysis and resistance to 14 antimicrobial agents in selected strains of Escheríchía colí isolated from diarrheic piglets. Five (21 %) out of  24 strains were colicinogenic while 4 (7%) out of 61 strains were hemoJitic; 100% of colicinogenic and hemolitic strains exhibited multiple drug resistaance. All strains were resistant to neomycim (Nm), estreptomicyn (Sm), tetracycline (Tc) and triple sulfa (Ts).lsolates were resistant to at least 6 up to 11 antimicrobials. The lowest frecuency of resistance were showed to gentamycin (Gm), cephalotin Cf) and colistin (CI). None of the strains exhibited resistance to polimixin B (PB) and nalidixic acid (NA). A hight proportion of R determinants was linked to transmisible plasmids. However transfer wasnot observed for colicine and hemolysis production. 

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