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Veterinaria Tropical 16: 17-28. 1991 EVALUACIÓN A CAMPO DE UNA
VACUNA INACTIVADA BIVALENTE M.
Toro Benítez*, E. León Arenas*, A. T. Guillén*, J. A. García, *FONAIAP |
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RESUMEN Se evaluó, en condiciones de exposición a campo, la capacidad protectiva de una vacuna inactivada bivalente (mezcla de exoántigenos de B. bovis y B. bigemina) en rebaños susceptibles constituidos por bovinos de leche y/o carne, de diferentes razas y edad, ubicados en diferentes regiones de Venezuela. La vacuna se elaboró a partir del cultivo in vitro de cepas autóctonas de Babesia y se aplicó por vía subcutánea, en dos dosis con intervalo de cuatro semanas. Grupos representativos del rebaño (vacunados y no vacunados) fueron examinados mensualmente, mediante métodos parasitológicos y serológicos, por lapsos de hasta dos años. Los bovinos vacunados mostraron un buen grado de seroconversión post-vacunación, no habiéndose registrado mortalidad por causa de Babesia entre ellos, después de la exposición eventual en áreas infestadas por garrapatas. Por otra parte, los bovinos controles no vacunados mostraron diferencias significativas en cuanto a morbilidad (infección por Babesia) y mortalidad (muerte por Babesia comprobada en laboratorio) .Se concluye que la vacuna inactivada bivalente contra la babesiosis, origen de cultivo, constituye un método seguro, fácil y práctico para controlar y/o prevenir la babesiosis, en las condiciones enzoóticas existentes en Venezuela y que, en tanto no se logre una vacuna sintética, objeto de muchas investigaciones actuales, la vacuna de exoantigeno es una herramienta importante en la inmunoprofilaxis de esta hemoparasitosis. INTRODUCCIÓN La babesiosis bovina constituye uno de los principales obstáculos en el desarrollo de la industria ganadera de países tropicales y sub tropicales (1 , 12). En Venezuela, estudios epidemiológicos realizados en diferentes zonas del país muestran que la babesiosis tiene una alta prevalencia en los rebaños nacionales (6, 29) y que el riesgo a contraer la infección varía según el sistema de cría y manejo, procedimientos preventivos utilizados, tamaño y distribución del rebaño (16). En la inmunoprevención de la babesiosis bovina se ha intentado la aplicación de diversos procedimientos, siendo los más comunes la premunición y el uso de vacunas vivas atenuadas (2, 3, 4, 5, 13, 21, 22, 23, 24). Sin embargo, todos los métodos hasta ahora utilizados presentan serios inconvenientes y/o desventajas: poca estabilidad, reversión a virulencia y diseminación de otros micro-organismos patógenos (10, 11). Las perspectivas de un método inmunoprofiláctico práctico y seguro contra la babesiosis han mejorado sustancial mente con el desarrollo de técnicas para el cultivo in vitro de Babesia bovis (9) y B. bigemina (30) y la obtención de antígenos solubles provenientes de los mismos. Vacunaciones experimentales en condiciones controladas de laboratorio realizadas en México, Estados Unidos de Norteamérica, Australia, Venezuela y Brasil han mostrado que los exoantígenos de Babesia, presentes en el sobrenadante de cultivo, poseen una eficiente capacidad de protección homóloga y hasta cierto punto heteróloga frente al desafío o reto experimental con organismos virulentos de diferentes cepas de B. bovis y B. bigemina (7, 8, 14, 15,19, 20, 26, 27, 28). No obstante, la evaluación final de un inmunógeno requiere del análisis de su eficaciá en condiciones de campo. En el presente trabajo se reseñan los resultados de una evaluación a campo de un inmunógeno bivalente B. bovis/B. bigemina constituido por exoantígenos de cultivo, frente a la exposición natural a la infección en las condiciones enzoóticas existentes en Venezuela. MATERIALES Y MÉTODOS Selección de Fincas Las pruebas se realizaron en fincas oficiales y privadas, ubicadas en varios estados del país, en rebaños conformados por bovinos de leche, carne o doble propósito sometidos a variadas condiciones epidemiológicas y de manejo. Las fincas se seleccionaron de acuerdo con los siguientes criterios: 1) alto riesgo de los animales a contraer la infección (rebaños en condiciones de inestabilidad enzoótica, bovinos altamente susceptibles, generalmente importados y su descendencia; 2) rebaños sometidos a prácticas diferentes de cría y manejo, dependiendo de la región y tamaño de la finca y 3) facilidades para el seguimiento, observación y control de grupos representativos (vacunados y no vacunados) del rebaño bajo estudio. Las fincas seleccionadas, 16 en total, representaban una población de 16500 bovinos, de los cuales 2815 fueron vacunados; se realizó un seguimiento parasitológico, clínico y serológico post-vacunación, que osciló entre uno y dos años, en aproximadamente un 20% de animales vacunados con la inclusión de un número similar de bovinos controles. Seguimiento Longitudinal El seguimiento de grupos representativos del rebaño (vacunados versus controles) se realizó mediante muestreos mensuales, en los cuales, se recolectaron muestras de sangre con anticoagulante (EDTA disódico, 2,0 mg/ml) y sangre sin aditivos para suero. En las muestras de sangre se determinó el hematocrito (técnica del microhematocrito) y parasitemia (en frotis delgados teñidos por Giemsa). En sueros sanguíneos, se determinó la presencia de anticuerpos mediante la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFA), según técnica descrita por ROSS y LOHR (25). Se hicieron otras observaciones tales como ganancia de peso corporal (en fincas de carne y/o doble propósito), presencia de garrapatas, morbilidad o casos de babesiosis ocurridos en el rebaño (calculada sobre la base de una combinación de infección por Babesia comprobada en frotis sanguíneos y caída del hematocrito) y mortalidad (porcentajes de muertes por babesiosis, con diagnóstico clínico confirmado en laboratorio). Vacunas y Esquema de Vacunación Cada dosis de vacuna bivalente consistió de una mezcla de exoantígenos de cultivo de Babesia (B. bovis = 2,0 ml/eq., B. bigemina = 3,0 ml/eq.), concentrada por liofilización y adicionada de Saponina Quil-A como adyuvante (1 ,5 mg/dosis). La vacuna se aplicó por vía sub-cutánea en dos dosis con intervalo de un mes entre inoculaciones. En la elaboración de la vacuna se utilizaron tres cepas de B. bovis (Yaracuy, Zulia y Guárico) y dos cepas de B. bigemina (Yaracuy y Zulia). Las cepas se cultivaron de acuerdo con el método microaerófilo en fase estacionaria (MASP) (9) para B. bovis, siguiendo para el cultivo de B. bigemina las recomendaciones de VEGA et al. (30). La preparación del inmunógeno bivalente inactivado constó de las siguientes etapas: 1) recolección diaria del sobrenadante de cultivo durante un lapso de tres días; 2) centrifugación y filtración (Millipore de 0,45 micras); 3) liofilización; 4) adición de Saponina Quil-A (1,5 mg/dosis) y 5) almacenaje a 4°C. Para su uso, la vacuna se reconstituyó en el momento de su aplicación con agua destilada estéril neutra (2,0 mi/dosis). Análisis de Resultados Para evaluar la eficacia de la vacuna, en condiciones de campo, se utilizó una adaptación del método recomendado por ORENSTEIN et al. (18), comparando en vacunados y controles sin vacunar los siguientes parámetros: seroconversión post-vacunación y desafío, morbilidad, mortalidad y ganancia de peso. RESULTADOS De las 16 fincas bajo estudio, once (69%) constaban de rebaños en condiciones de inestabilidad enzoótica, caracterizados por un alto riesgo a la infección y enfermedad clínica y con prevalencia serológica negativa baja. Cinco (35%) de las fincas fueron consideradas enzoóticamente estables, es decir con rebaños de bajo riesgo a enfermedad clínica y con alta prevalencia de anticuerpos (prueba de inmunofluorescencia indirecta). En el Cuadro 1 se muestran las principales características de las fincas, con señalamiento de la población bovina, raza, edad, tipo de manejo y condición epizootológica. Exposición directa en áreas infestadas por Boophilus microplus ocurrió en un 75% (12) de las pruebas, en las cuales los animales fueron eveiltualmente sometidos a pastoreo entre 1 y 6 meses post-vacunación. En el resto de las fincas (25%) hubo exposición indirecta a la infección, dada por el manejo y/o sistema de alimentación (riesgo de garrapatas en el pienso, por ejemplo). En los Cuadros 2, 3 y 4 se agrupan las pruebas de campo de acuerdo con la susceptibilidad de los rebaños, dependiente ésta de la raza, edad y procedencia de los animales (bovinos de zonas libres), métodos de cría, manejo y prevención de vectores. En el Cuadro 2 se muestran los resultados del análisis del primer grupo de fincas, las cuales, constaban de rebaños de bovinos puros raza Holstein, importados de E.U.A. y Canadá, con edades col11prendidas entre 1,5 y 3 años, en condiciones de inestabilidad enzoótica (estabulación permanente y control sistemático de garrapatas).
En este grupo se observó un buen grado de seroonversión post-vacunación (promedios de 1:172 y 1:321 para B. bovis y B. bigemina, respectivamente) y post-exposición a potrero ( 1:538 y 1:582 para B. bovis y B. bigemina frente a valores de 1:106 y 1:88 de los controles). En tres fincas de este grupo los animales fueron expuestos a potrero entre 3 y 6 meses post-vacunación, observándose grandes diferencias en los valores de seroconversión al comparar los grupos vacunados y controles. La morbilidad en bovinos no vacunados duplicó a la observada en bovinos vacunados (valores máximos de 20% en vacunados y 40% en no-vacunados). en tanto que la mortalidad fue de 10% en bovinos controles no vacunados (causa de muerte confirmada en laboratorio), en dos de las fincas del grupo (pruebas No.1 y No.13). No se observaron muertes en animales vacunados. estimándose por lo tanto un 100% de protección a mortalidad. En el Cuadro 3 se presentan los resultados del análisis del grupo No.2, conformado por rebaños de leche puros (una finca) y mestizos, jóvenes y adultos, con edades entre 6 meses y 4 años, en diferentes condiciones de manejo (semi-estabulación y baños garrapaticidas sistemáticos) y variada situación epizootológica. En este grupo se observó igualmente un buen grado de seroconversión post-vacunación y desafío (B. bovis= 1:426; B. bigemina= 1:393). siendo lo más notable la aparición de un brote agudo de babesiosis en animales no vacunados de la prueba No.4. En dicha finca, con un rebaño de bovinos puros Pardo Suizo. se constató una alta morbilidad post-desafío a potrero con mortalidad de140% en bovinos controles (B. bovis como causa de muerte comprobada en laboratorio). No se registraron muertes en los animales vacunados. observándose de nuevo un 100% de protección a mortalidad en bovinos que recibieron la vacuna contra la babesiosis. Los resultados del análisis del tercer grupo de fincas aparecen en el cuadro 4; los grupos estaban conformados por rebaños de bovinos mestizos, de carne o doble propósito, jóvenes y adultos con edades entre seis meses y tres años, en condiciones epizootológicas variadas, generalmente a pastoreo y con control esporádico de ectoparásitos. En algunas fincas de este grupo fue posible determinar el peso corporal de los animales durante el desarrollo de las pruebas, comprobándose diferencias significativas favorables en los grupos vacunados de las pruebas No.2 (ganancia promedio de peso en vacunados = 12,2 kg, controles = 4,5 kg) y No.3 (vacunados = 13,5 kg, controles = 8,5 kg). La morbilidad en este grupo resultó igualmente mayor en bovinos no vacunados, constatándose hasta un 50% de morbilidad y un 25% de mortalidad en una de las fincas (prueba No.3). No se registraron muertes por babesiosis en bovinos vacunados (100% de protección a mortalidad). Por otra parte, hubo gran diferencia en seroconversión al comparar los títulos promedios IFA de los grupos vacunados y controles (B. bovis = 1:202 versus 1:129; B. bigemina = 1:720 versus 1:231 ). En todos los rebaños bajo seguimiento se observó además la presencia de otras infecciones (tripanosomiasis, rabia, brucelosis) con predominio de la anaplasmosis, registrada en 14 (B7,5%) de las pruebas realizadas.
DISCUSIÓN Los métodos inmunoprofilácticos utilizados hasta la fecha constituyen un riesgo para los animales (10, 11) ya que todos ellos se basan en la aplicación de organismos vivos, atenuados por diversos procedimientos (2, 3, 23, 24) o simplemente criopreservados (13, 21), métodos en los cuales, se mantiene en mayor o menor grado la virulencia y patogenicidad de los hemoparásitos. El uso de exoantígenos como método de inmunización contra la babesiosis no había sido hasta el presente evaluado en condiciones de campo y excepto una vacuna contra la babesiosis canina, utilizada en Francia con éxito (17), no existen referencias mundiales en relación con el tipo de vacuna objeto de nuestra evaluación. Los investigadores franceses señalan una eficiencia del 90% en perros vacunados con exoantígenos de cultivo para la inmunoprevención de la babesiosis causada por B. canis (17). Nuestra experiencia señala una eficiente protección tanto en morbilidad como en mortalidad en bovinos vacunados con un inmunógeno mixto (exoantígeno de cepas venezolanas de B. bovis y B. bigemina cultivadas in vitro) y desafiados en condiciones naturales. En 2815 bovinos vacunados, distribuidos en 16 fincas lecheras y/o cárnicas ubicadas en diferentes regiones de Venezuela y bajo diferentes condiciones de manejo, no se registraron brotes o casos de la enfermedad aunque cierto porcentaje de los animales se infectaron con Babesia (hasta 20 de morbilidad en vacunados). Por otra parte, se registró tanto morbilidad como mortalidad en bovinos no vacunados (hasta 50 y 40%, respectivamente), siendo lo más notable el brote de babesiosis surgido en la prueba No.4, con un 40% de mortalidad en animales controles. El grado de exposición varió en las diferentes pruebas realizadas, dependiendo del sistema de manejo al cual estuvieron sometidos los rebaños. En general, rebaños de animales altamente susceptibles (bovinos de raza pura importados, por ejemplo) son mantenidos bajo rigurosa protección (estabulación permanente, baños garrapaticidas sistemáticos, etc.), lo cual hace que el riesgo a contraer la infección por Babesia sea relativamente bajo, excepto en situaciones irregulares como el acarreo de larvas de garrapatas en el pasto. Sin embargo, en el 75% de los casos los bovinos fueron eventualmente expuestos a la infección, bien en pequeños grupos movilizados a pastos infectados con Boophilus microplus o en grupos mayores trasladados a otras regiones del país (prueba No.1). En esta última prueba, realizada en el estado Zulia y con un total de 600 animales raza Hoistein vacunados, el rebaño se disgregó y fue movilizado a otras zonas del país (estados Trujillo y Aragua) sin que los animales presentaran síntomas de la enfermedad. Un caso patente ocurrió en la prueba No.4, en la cual surgió un brote de babesiosis, entre tres y cuatro meses post-exposición a potrero, el cual no afectó a bovinos vacunados. La vacuna objeto de evaluación probó ser efectiva para la prevención de la mortalidad y en gran parte de la morbilidad causada por la babesiosis bovina, en las condiciones de exposición enzoótica existentes en el país. En bovinos de carne y/o de doble propósito, además los animales vacunados mostraron una mejor conversión alimenticia en relación a los no vacunados. La vacuna inactivada bivalente contra la babesiosis bovina mostró ser un método inmunoprofiláctico práctico, eficaz y seguro para la prevención de esta enfermedad, y en tanto no se logre una vacuna con técnicas modernas de ingeniería genética (vacunas de subunidad y/o con péptidos sintéticos), meta de muchas de las investigaciones actuales en el mundo, la vacuna elaborada con exoantígenos de cultivo constituye una herramienta de utilidad y valor para el control y/o prevención de la babesiosis bovina, en las condiciones enzoóticas actuales de Venezuela. SUMMARY The protective capacity of a bivalent (mixed of exoantigens of B. bovís and B. bígemína) inactivated vaccine was evaluated in susceptible milk and/or beef herds comprised by animals of different breeds and ages, in various regions of Venezuela. The vaccine. elaborated by culture of Venezuelan strains of Babesia, was applied by subcutaneous route in two doses at 4 weeks interval and. representative groups of the herds (vaccinated and unvaccinated animals) were examined monthly by parasitological and serological methods for up 2 years periods. Vaccinated animals showed a good degree of seroconversion and no mortality due to Babesia was reported within them after challenge exposure to tick infected areas. On the other hand. control animals showed significative differences on morbility (Babesia infection) and mortality (death due to Babesia, with affirmative diagnose at laboratory). It is concluded. that the bivalent inactivated culture-derived vaccine is a safe, easy to apply and effective method to control and/or prevent bovine babesiosis. under the enzootic conditions of Venezuela and. meanwhile a synthetic vaccine is achieved (goal of many investigations today), the exoantigens vaccine is an important tool for the immunoprophylaxis of this type of hemotropic disease. BIBLIOGRAFÍA
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