|
Veterinaria tropical. Vol. 18. 23-37. 1993. USO
DE UNA V ACUNA POLIVALENTE INACTIVADA EN LA INMUNIZACI�N DE BOVINOS M.
Toro Ben�tez*, S. Montenegro-James**, E. Le�n Arenas*,
1Investigaciones auspiciadas por Convenio FONAIAP-Universidad
de Illinois, |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
RESUMEN Se evalu�, en condiciones controladas de laboratorio, la eficacia protectiva de un inmun�geno inactivado combinado (cuerpos iniciales de Anaplasma marginale m�s exoant�genos de cultivo de Babesia bovis y B. bigemina), usando bovinos susceptibles adultos raza Holstein. La vacuna polivalente se aplic� por v�a subcut�nea en dos dosis con un intervalo de 30 d�as entre dosis y tres meses post-vacunaci�n, todos los animales (vacunados y controles) fueron desafiados con organismos virulentos de cepas heter�logas de A. Marginale, B. bovis y B. bigemina. La capacidad protectiva se estim� con base en una comparaci�n, entre vacunados y testigos, de las variaciones de par�metros cl�nicos y fisiopatol�gicos post -desaf�o. El grado de protecci�n inducido hizo posible que los animales vacunados sobrevivieran, sin tratamiento, a un desaf�o triple con par�sitos de reconocida virulencia; en tanto que, los animales controles mostraron signos cl�nicos agudos de enfer- medad, requiriendo tratamiento despu�s del reto parasitario. El an�lisis inmunoqu�mico (SDS-PAGEy WIB) de ant�genos de A. marginale (cuerpos iniciales) y de Babesia bovis y B. bigemina (ant�genos merozo�ticos) mostr� tanto bandas proteicas �nicas como comunes, reconocidas por sueros in- munes post-vacunaci�n y desaf�o. Dado que la presencia de ant�genos protectivos comunes es esencial para el desarrollo de vacunas efectivas, este hallazgo es de particular importancia. La vacuna inactivada polivalente ofrece, en tanto no se logren vacunas de sub-unidad, una halagadora perspectiva en la prevenci�n simult�nea de la anaplasmosis y babesiosis de los bovinos. INTRODUCCI�N En la mayor�a de los pa�ses de Am�rica Latina, tres especies de hemopar�sitos son consideradas como los agentes pat�genos de mayor importancia para los bovinos: La rickettsia Anaplasma marginale (Theiler, 1910) y los protozoarios Babesia bovis (Babes, 1888) y Babesia bigemina (Smith y Kilbourne, 1893), (27). Tanto el Anaplasma como las Babesia son transmitidas por garrapatas del g�nero Boophilus, las cuales, en los climas tropicales y sub tropicales evolucionan en condiciones favorables, resultando muchas veces la aparici�n de infecciones mixtas en los bovinos (4,14). En Venezuela, el control de la anaplasmosis y babesiosis se basa fundamentalmente en el uso terap�utico o profil�ctico de drogas anti parasitarias espec�ficas (31), lo cual, generalmente resulta muy costoso o parcialmente efectivo (21). De aqu� que el desarrollo de vacunas eficaces, seguras y de f�cil aplicaci�n contra estas enfermedades constituya una necesidad actual ya que con ello se lograr�a un control y/o prevenci�n a un costo menor, se disminuir�an las p�rdidas ocasionadas y se obtendr�a una mejor y mayor expansi�n de la industria ganadera en las �reas end�micas. Los m�todos inmunoprofil�cticos actualmente en uso para prevenir la anaplasmosis y la babesiosis incluyen: 1. Premunici�n con sangre de animales portadores u organismos atenuados en forma natural. Con este m�todo, sin embargo, existe el riesgo de producir la enfermedad cl�nica y, ocasional- mente, la muerte de los animales (1, 11,25).2. Vacunaci�n con organismos vivos atenuados en laboratorio. Vacunas de este tipo han sido utilizadas con �xito en Australia (5,8, 9, 29) en la prevenci�n de la babesiosis causada por B. bovis y B. bigemina y una vacuna atenuada ovinizada de A. marginale ha mostrado proveer una adecuada protecci�n y adaptaci�n de bovinos j�venes en condiciones tropicales (7, 26). Sin embargo, factores tales como la limitada viabilidad, la estricta dependencia de una cadena fr�a para su mantenimiento y la variable infectividad, adem�s del riesgo de contaminaci�n con otros agentes pat�genos (6, 8, 29) han limitado la aplicaci�n pr�ctica de vacunas vivas en la mayor�a de los pa�ses tropicales (2,12 17). El severo obst�culo representado por la anaplasmosis y la babesiosis para el desarrollo y la producci�n ganadera, as� como la carencia actual de un m�todo inmunoprofil�ctico enteramente satisfactorio para su control, dan una alta prioridad a la b�squeda de vacunas inocuas y efectivas. Estas metas se han tratado de alcanzar a trav�s de dos l�neas fundamentales de investigaci�n: 1. El desarrollo y/o mejoramiento de vacunas inactivadas convencionales (13,18) y 2. La aplicaci�n de tecnolog�a DNA recombinante para la obtenci�n de ant�genos seleccionados (24, 30). El logro de estos �ltimos objetivos, no obstante, est� a�n supeditado a investigaciones b�sicas considerables, especialmente en la definici�n de ep�topes antig�nicos protectivos y la selecci�n de adyuvantes y v�as de aplicaci�n eficientes. Recientemente, se ha descrito la eficacia protectiva de una vacuna corpuscular purificada ( cuerpos iniciales de A. marginale) contra la anaplasmosis (20) y estudiado extensivamente, el efecto protector tanto en condiciones de laboratorio como de campo, de una vacuna inactivada contra la babesiosis bovina elaborada bas�ndose en exoant�genos de cultivo (18, 19, 32). En el presente trabajo se informan los resultados de un estudio dise�ado con el objeto de determinar la eficacia protectora de una vacuna inactivada combinada,A. marginale, E. bovis, E. bigemina, frente a un reto parasitario con organismos heter�logos virulentos en condiciones controladas de laboratorio. MATERIALES Y M�TODOS Animales Experimentales Se utilizaron bovinos puros raza Holstein, serol�gicamente negativos a la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFA) para Anaplasma y Babesia spp., de aproximadamente 14 meses de edad, los cuales se mantuvieron en estricto aislamiento en galpones cerrados a prueba de vectores y se alimentaron a base de concentrado, heno yagua ad libitum. Adicionalmente, se esplenectomizaron becerros de 3 a 4 meses de edad para ser usados como reactivadores de las cepa de exposici�n Cepas de Hemopar�sitos Se utilizaron cepas de A. marginale, B. bovis y B. bigemina aisladas durante brotes de anaplasmosis y babesiosis en diferentes regiones de Venezuela, las cuales fueron mantenidas como "estabilizados criopreservados" en el Cepario del Instituto de Investigaciones Veterinarias. En la elaboraci�n de la vacuna corpuscular purificada ( cuerpos iniciales de Anaplasma) se utiliz� la cepa Florida de A. marginale. De las cepas de A. marginale aisladas en Venezuela, la cepa Cojedes hab�a mostrado, al examen mediante coloraci�n de nuevo azul de metileno, la presencia de ap�ndice caudal; en tanto que, la otra cepa venezolana (Atacoso, Edo. Zulia) y la cepa Florida no presentan dicho ap�ndice (Figura 1). Producci�n de Inmun�genos Los cuerpos iniciales de A. marginale fueron obtenidos y purificados mediante una combinaci�n de disrupci�n ultras�nica, tratamiento con detergentes no i�nicos y centrifugaci�n diferencial, seg�n m�todo descrito (20). De un bovino esplenectomizado infectado con A. marginale ( cepa Florida) se recolect�, al pico de parasitemia y en forma as�ptica, sangre parasitada usando EDTA (2,0 mg/ml como anticoagulante). A fin de remover anticuerpos adherentes, los eritocitos se separaron y lavaron con soluci�n buffer de glicina (0,lM, pH = 3,0) y, seguidamente, con soluci�n salina buffer fosfatada (PBS, pH = 7,4) en presencia de inhibidores de proteasas (3,5 m M tetrationato de sodio (Sigma Chemical Co., St. Louis, M. O, EUA) y timerosal al 0,01 %. El paquete celular, diluido 1:5 en PBS, se sonic� dos veces a 20 kilociclos, a un flujo de 40 mI por minuto. El material sonicado se congel� y descongel� tres veces para asegurar una completa lisis celular. Se sonic� nuevamente y se diluy� en partes iguales con PBS adicionado de 1% de Nonidet-40 (detergente no i�nico). Los cuerpos iniciales de A. marginale se separaron mediante centrifugaci�n y se suspendieron en soluci�n salina balanceada de Han k (HBSS). La concentraci�n de prote�nas se determin� mediante el m�todo de Lowry modificado (20). Los inmun�genos (exoant�genos) de B. bigemina y B. bovis, derivados de cultivo y libres de contaminaci�n eritroc�tica, se prepararon seg�n procedimientos descritos por Montenegro-James et al (18,19). Los cultivos se iniciaron con sangre infectada de bovinos inoculados individualmente con cada una de las especies de Babesia. El medio de cultivo consist�a de Medio 199 (Sigma Chemical Co., St. Louis, M. O, EVA) suplementado con 40 y 20% de suero bovino normal para B. bovis y B. bigemina, respectivamente y antibi�ticos (penicilina, 100 VI/mI yestreptomicina, 100 mg/ml). Los cultivos se incubaron a 37�C en una atm�sfera de 3% de CO2 y ambiente humidificado. Los sobrenadantes de cultivo, recolectados diariamente durante un lapso de tres d�as, se centrifugaron, mezclaron, filtraron (flltro Millipore 0,45 .μ) y se liofilizaron.
La vacuna polivalente consisti� de una mezcla de exoant�genos de B. bovis (2,0 ml/eq.) y B. bigemina (3,0 ml/eq), liofilizada y reconstituida con 3,0 ml de agua destilada est�ril, pH = 7,0, que conten�a 0,1 mg de prote�nas de A. marginale (cuerpos iniciales purificados) y 3,0 mg de Saponina Quil-A (Superfos Biosector a/s, Denmark) como adyuvante. An�lisis Antig�nico Mediante las t�cnicas de inmunoelectrof�resis (SDS-P AGE) y Western Inmunoblott (WIB) se analizaron preparaciones antig�nicas, en geles gradientes (6-12%) de poliacrilamida, en condiciones reducidas, para luego ser transferidas a papel de nitrocelulosa (0,45 μ); como ant�genos de Anaplasma se utilizaron cuerpos iniciales de las cepas Florida, Atacoso y Cojedes. A partir de la sangre de becerros esplenectomizados infectados con B. bigemina o B. bovis se prepararon ant�genos merozo�ticos para an�lisis por inmunoblott (22). Los ant�genos se pusieron de manifiesto mediante el desarrollo inmunoblotts con sueros de bovinos vacunados y no vacunados, de acuerdo con las recomendaciones de TSANG et al (33). Dise�o Experimental Nueve bovinos raza Holstein, susceptibles a Anaplasma y Babesia se dividieron en dos grupos de cinco y cuatro cada uno. El grupo 1 (n = 5) recibi� la vacuna polivalente inactivada, la cual consist�a de 0,1 mg de prote�nas de cuerpos iniciales de A. marginale adicionadas de 5,0 m1Ieq de exoant�genos combinados de B. bovis y B. bigemina, suplementados con 5,0 mg de Saponina Quil-A/dosis como adyuvante. Los animales fueron vacunados por v�a subcut�nea con dos dosis e intervalo de un mes entre dosis (d�as: 0 y 30). El grupo 2 (n = 4) permaneci� como controles no vacunados. Tres meses post-vacunaci�n, todos los animales fueron desafiados mediante inoculaci�n intravenosa de sangre fresca que conten�a 1 x 109 eritrocitos infectados con organismos heter�logos de A. marginale ( cepa Cojedes) y tres d�as despu�s, con 1 x 108 eritrocitos parasitados con cepas heter�logas de B. bovis y B. bigemina. A trav�s de todo el experimento, se obtuvieron datos en relaci�n con la temperatura corporal, hematocrito, niveles de plaquetas y fibrin�geno, parasitemia (en frotis de sangre te�idos por Giemsa), peso corporal y respuesta de anticuerpos (prueba IFA). Los niveles de fibrin�geno plasin�tico se determinaron mediante la prueba de inmunodifusi�n radial (3). La significancia estad�stica de las diferencias entre los promedios de losgrupos experimentales (vacunados y no vacunados) se calcul� mediante la prueba "t". RESULTADOS Y DISCUSI�N En la Figura 2 se muestran los niveles de anticuerpos IF A obtenidos en respuesta a la vacunaci�n con el inmun�geno polivalente multipar�sito (cuerpos iniciales de A. marginale y exoant�genos de B. bovis y B.. bigemina) y despu�s del reto parasitario con cepas heter�logas virulentas. Los m�ximos niveles de anticuerpos s�ricos post-vacunaci�n se observaron a las 2, 3 y 5 semanas despu�s de la segunda dosis vacunal para B. bovis (1:211), B. bigemina (1:1689) y A. marginale (1:1940), respectivamente. La re actividad serol�gica cruzada entre ant�genos de B. bovis y B. bigemina ha sido ya se�alada por otros autores (16, 20); se�al�ndose, adem�s, que los antisueros de B. bovis reaccionan fuertemente con el ant�geno de B. bigemina (34). En un estudio previo, se observaron altos y persitentes t�tulos de anticuerpos frente al ant�geno de B. bigemina en sueros inmunes de B. bovis (19). De aqu�, que los altos t�tulos IFA para B. bigemina (1:1689) observados en la presente investigaci�n, podr�an ser atribuidos a la afinidad que presentan los anticuerpos de B. bovis por el ant�geno de B. bigemina. Los presentes resultados confirman los hallazgos anteriores. Los niveles de anticuerpos declinaron gradualmente hasta t�tulos de 1:160 (B. bigemina), 1:40 (B. bovis) y 1:40 (A. marginale) para el momento del desaf�o con cepas virulentas (3 meses post-vacunaci�n). Despu�s del reto parasitario, se observ� una r�pida y fuerte respuesta anamn�sica, con t�tulos que aumentaron consistentemente por un per�odo de tres semanas (Figura 1). En el Cuadro 1 se hace una comparaci�n de las variaciones fisiopatol�gicas en bovinos vacunados y controles, como �ndices de la protecci�n cl�nica inducida por la vacuna inactivada polivalente. La vacuna combinada ( cuerpos iniciales de A. marginale m�s exoant�genos de B. bovis y B. bigemina) indujo una protecci�n moderada frente al desaf�o con cepas virulentas. Sin embargo, las alteraciones fisiopatol�gicas en los animales vacunados fueron de corta duraci�n, en comparaci�n con los animales controles. El grado de protecci�n conferido por la vacuna hizo posible que los animales vacunados sobrevivieran a un desaf�o triple con par�sitos de reconocida virulencia, mostrando trastornos cl�nicos relativamente menos intenso que los observados en los testigos. Por otra parte, el retorno a valores normales de hematocrito se produjo en menor tiempo y los hemopar�sitos circulantes fueron eliminados r�pidamente.
Todos los bovinos controles mostraron signos agudos de enfermedad con diferencias significativas en todas las variables cl�nicas y fisiopatol�gicas analizadas, requiriendo, adem�s, tratamiento espec�fico y de soporte despu�s del desaf�o parasitario (Cuadro 1). En la Figura 3 se muestran los resultados del an�lisis inmunoqu�mico mediante la t�cnica de Western Inmunoblotting (WIB) de sueros in- dividuales de animales vacunados, recolectados dos semanas despu�s del desaf�o y de sueros controles (bovinos no vacunados), los cuales se hicieron reaccionar con prote�nas de cuerpos iniciales de A. marginale, cepas Florida, Atacoso y Cojedes. Una banda proteica principal de 38 kilo Daltons (kDa) fue reconocida en los sueros de animales vacunados en todas las cepas de A. Marginale analizadas. Los sueros inmunes de los bovinos vacunados reaccionaron fuertemente con un m�nimo de 12 polip�ptidos de la cepa Cojedes de A. matginale (cepa de exposici�n, con ap�ndice caudal), identific�ndose polip�ptidos �nicos de 89, 84, 42, 40 y 35 KDa. Bandas proteicas �nicas de 27 y 24 kDa fueron constatadas en la cepa Florida de A. marginale. Un m�nimo de seis ant�genos comunes (110,73,65,38,34 y kDa) a las tres cepas de A. marginale fueron reconocidos en los sueros de bovinos inmunes (Figura 3). Este hallazgo es particularmente importante ya que la presencia de ant�genos comunes protectivos es indispensable para el desarrollo de vacunas eficientes y de amplio espectro de protecci�n contra la anaplasmosis (23, 24). En estudio reciente (20), se observ� un buen grado de protecci�n cruzada cuando bovinos vacunados con cuerpos iniciales de la cepa Florida fueron desafiados con una cepa virulenta de A. marginale de Venezuela (cepa Yaracuy, sin ap�ndice caudal). En el presente estudio, se seleccion� la cepa Cojedes para el desaf�o heter�logo por ser una cepa de campo que hab�a mostrado, en inoculaciones previas, una alta virulencia y con la caracter�stica morfol�gica del ap�ndice caudal, en contraste con la cepa Florida, la cual, carece de dicho ap�ndice. La protecci�n de los bovinos vacunados frente a la exposici�n heter�loga indic� la presencia de ep�topes protectivos comunes en dos cepas de A. marginale, antig�nica y estructuralmente diferentes (Florida no caudada y Cojedes con ap�ndice caudal). Protecci�n cruzada similar entre la cepa Florida y la cepa caudada Washington-O, ha sido se�alada por PALMER el al (23).
En la Figura 4 se muestran los resultados del an�lisis por Western Inmunoblotting (WIB) de sueros individuales de animales vacunados, recolectados dos semanas despu�s de la exposici�n y de animales controles (bovinos no vacunados) los cuales, fueron re activados con ant�genos merozo�ticos heter�logos de B. bovis y B. bigemina. El an�lisis mostr� que los sueros de animales vacunados reaccionaron fuertemente en un rango que oscil� entre 179 y 21 kDa, resultando la mayor�a de los ant�genos comunes a ambas especies de Babesia. Las principales bandas proteicas comunes en las especies fueron identificadas a 163, 64 y 33 k Da. Sin embargo, tambi�n fueron identificadas tres ant�genos especie-espec�ficos (153, 113 y 42 k Da) en B. bovis y polip�ptidos �nicos de B. bigemina (104, 72 y 45 kDa). La similitud antig�nica y la posible relevancia de ep�topes de protecci�n cruzada entre B. bovis y B. bigemina no ha sido a�n conclusivamente correlacionadas con una protecci�n significativa (28, 34). Otros autores han encontrado que la glicoprote�na especie-espec�fica 42 kDa de B. bovis es la prote�na de superficie inmunodominante en bovinos protegidos (10) y que el ant�geno espec�fico 45 kDa de B. bigemina es capaz de inducir protecci�n parcial contra el desaf�o virulento hom�logo (15). Dado estos hallazgos, el uso de un inmun�geno combinado B. bovis/B. bigemina es a�n estrictamente necesario para garantizar una adecuada protecci�n contra los efectos pat�genos de las babesiosis en los bovinos. Finalmente, se podr�a concluir que mientras no est�n completamente desarrolladas las vacunas de sub-unidad, una vacuna inactivada polivalente compuesta de exo-ant�genos de cultivo de Eabesia y de cuerpos iniciales purificados de A. marginale puede ofrecer la mejor combinaci�n de seguridad y eficacia contra la babesiosis y la anaplasmosis, enfermedades hemoparasitarias que causan cuantiosas p�rdidas en la ganader�a bovina de tr�picos y sub-tr�picos. SUMMARY The protective efficacy of an inactivated combined immunogen (Anaplasma marginale initial bodies plus Babesia bovis and B. bigemina culturederived exoantigens) was evaluated, under laboratory control conditions, using Holstein-bred susceptible adult cattle. Polyvalent vaccine was applied by subcutaneous route in 2 doses at 30 daysintervals and 3 months after vaccination, all animals (vaccinated and controls) were challenged with heterologous virulent organisms of A. marginale, B. bovis and B. bigemina strains. Protective capacity was estimated on the basia of variations of clinical and pathophysiological parameters in vaccinated and controls animals after challenge. The degree of protection conferred by the polyvalent vaccine enabled the immunized animals to survive. without treatment, a triple challenge with parasites of known virulence: whereas, control animals showed acute clinical signs and required treatment. SDS-P AGE and WIB analysis of A. marginale (initial bodies) and merozoitic B. bovis and B. bigemina antigens showed both unique and common protein bands, recognized by immune post-vaccination and challenge serum samples. Since the presence of common protective antigens is essential for development of effective vaccines, this finding is of particular importance. Until subunit vaccines are fu11y developed, a polyvalent inactivated vaccine offer the best perspective for simultaneous prevention of anaplasmosis and babesiosis in cattle. BIBLIOGRAF�A
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
