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Veterinaria Tropical 19: 83-90. 1994 COMPARACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE SERONEUTRALIZACION Y ELISA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA PSEUDORRABIA Nelly Arriojas*, César Obando*, A. Montoya* y Y. Cadenas* *FONAIAP
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias |
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RESUMEN Se
realizó un estudio comparativo de las pruebas de Seroneutralinción (SN) y ELISA para la
detección de anticuerpos contra el virus de Pseudorrabia porcina. Fueron procesados 327
sueros provenientes de una granja porcina ubicada en el estado Carabobo, en ambas pruebas
se obtuvieron resultados positivos en 172 sueros (52,6%) por ELISA y 112 sueros (34,3%)
por SN. Los sueros negativos por ELISA también resultaron negativos por SN. De los sueros
reconocidos como débilmente positivos por ELISA sólo 22% fueron detectados por SN, lo
que indica que no hubo correlación entre pruebas para este grupo de sueros (r = 0,22 <
0,34). Por el contrario, en los grupos de sueros positivos y positivos fuertes por ELISA,
la concordancia entre pruebas fue de 87% y 100%, respectivamente, mostrando una alta
correlación INTRODUCCIÓN La pseudorrabia, enfermedad causada por un herpesvirus (3), ha tomado importancia en la producción porcina ya que la intensificación de la industria de cerdos ha favorecido la diseminación del agente viral en las granjas. Esta enfermedad causa pérdidas económicas cuantiosas debido a la mortalidad neonatal, problemas reproductivos y atraso de los animales (6). En aquellos animales infectados sin evidencia de la enfermedad, en condiciones de stress, ocurre reactivación, reexcreción y diseminación del virus, perpetuando la infección en los rebaños (2). Por lo tanto, un requerimiento importante para el control o aplicación de un programa de erradicación es la disponibilidad de pruebas serológicas confiables y sencillas que permitan la detección de animales que han tenido contacto previo con el virus. En la actualidad existen varias pruebas para la detección de anticuerpos contra el virus de la Pseudorrabia (PRV), siendo las más recomendables la prueba lnmunoenzimática (ELISA) (2,5) y la Seroneutralización (SN) (11), por ofrecer ambas alta especificidad y buena sensibilidad. A pesar de que la prueba de ELISA es más sensible que la SN, esta última es la prueba de referencia por ofrecer resultados en valores internacionales (6). En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue comparar la prueba de referencia internacional con la prueba de ELISA, en sueros. MATERIALES Y MÉTODOS Para la realización de este trabajo fueron utilizados 327 sueros procedentes de una granja porcina ubicada en el estado Carabobo, de los cuales 212 correspondían a cerdos vacunados y 115 a cerdos sin vacunación. Cada uno de estos sueros se procesaron en forma doble por ambas pruebas. Técnica de ELISA: para el desarrollo de esta prueba se utilizaron dos tipos de kit comercial*: ELISA SCREENING y ELISA VERIFICACION, este último para comprobar los resultados obtenidos por ELISA CREENING . Los sueros fueron procesados de acuerdo a las recomendaciones de la casa comercial. Para la interpretación de la prueba ELISA los resultados se consideraron: negativos, débilmente positivos, positivos y positivos fuertes, tomando como referencia los valores de absorvancia de los Sueros controles respectivos, contenidos en el kit comercial (Cuadro l). Técnica de Seroneutralización: para la realización de la prueba de SN, se, elaboró el antígeno viral a partir de una cepa de Pseudorrabia aislada de un brote, a la cual se, le realizaron tres pases en la línea celular PK-15 y tres pases en la línea VERO, obteniéndose un lote con título 10 4,6/ml DICC-50 en cantidad suficiente para el procedimiento de los sueros. Se confrontaron diluciones dobles de sueros problemas en medio de Eagle, desde 1:2 hasta 1:128, con 100 DICC-50 de antígeno, por un período de una hora a 37 "C. Seguidamente se adicionó suspensión de células VERO a una concentración de 500 000 cel/ml más 10% de suero fetal bovino. Se incorporaron sueros positivos de referencia y sueros negativos, así como control de unidades virales, células y sueros de campo. En cada prueba se incluyó una titulación simultánea para corroborar el número de dosis infecciosas usadas. Todos los volúmenes se ajustaron a 50,al y la lectura de la prueba se realizó después de un período de incubación de 96 horas en estufa de C02, a 37 "C. Los resultados obtenidos por SN fueron comparados con los resultados obtenidos por ELISA, mediante el método estadístico de Coeficiente de Correlación Biserial de Punto, con una confiabilidad de 99%. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados del procesamiento de 327 sueros de cerdos evidencian que la prueba de ELISA detectó 172 muestras con anticuerpos contra el VPR, en comparación con la prueba de SN que reconoció anticuerpos contra este virus sólo en 112 sueros. Es importante señalar que las muestras con resultados negativos por ELISA también lo fueron por SN y todas las muestras positivas por SN fueron positivas por ELISA (Cuadro 2). En la Figura se observa que sólo 22% de los sueros reconocidos como débilmente positivos por la prueba de ELISA resultaron positivos por la prueba de SN, indicando que no hubo correlación entre ambas pruebas, con relación a este grupo de sueros (r = 0,22 < 0,34). No así cuando se compararon los resultados de las pruebas en los grupos de sueros clasificados como positivos y positivos fuertes por ELISA, en donde la concordancia estuvo en 87% y 100%, respectivamente, indicando una alta correlación (r = 0,40 > 0,35).
En relación a los resultados de la prueba de ELISA y los títulos de anticuerpos detectados por SN se observó lo siguiente: en los sueros débilmente positivos los anticuerpos neutralizantes variaron desde negativos hasta 1:4; en los positivos los títulos estuvieron en un rango desde 1:2 hasta 1:64 y en los positivos fuertes los títulos oscilaron entre 1:8 y 1:64, (Cuadro 3).
El resultado obtenido es determinante, la prueba de ELISA es mucho más sensible que la prueba de SN al reconocer 18,3% más animales con anticuerpos contra el VPR (Cuadro 2), hallazgo que ha sido señalado en varios trabajos similares (2, 8, 9). Este hecho se explica, en parte, por la capacidad que posee la prueba de ELISA de detectar anticuerpos en animales primoinfectados, más temprano que la SN al reconocer diferentes clases de inmunoglobulinas (2,9). De manera adicional, es conocido que en algunos períodos postinfección los anticuerpos neutralizantes, inducidos mayormente por la glicoproteína gIII del VPR (3), están en niveles no detestables por SN (4, 11), mientras que estos anticuerpos generados por otras estructuras antigénicas del virus pudieran encontrarse en niveles detestables por ELISA (1, 10). Esto se corresponde con el incremento mostrado por los títulos de anticuerpos seroneutralizantes, en concordancia con los niveles ascendentes de positividad por ELISA (Cuadro 3). Desde el punto de vista práctico esto explica el por qué en rebaños infectados o en infecciones experimentales, los animales positivos únicamente por ELISA, en una primera sangría, resultan positivas por ambas pruebas en una segunda sangría. A pesar del uso de métodos estadísticos adecuados para el establecimiento de un nivel de punto de corte en la prueba de ELISA, no se descarta la posibilidad de que con ella se puedan registrar falsos positivos. Un aspecto importante a considerar es que no se obtuvo resultados positivos por SN en ninguno de los sueros negativos por ELISA, lo cual ha sido señalado por otros autores como ocasionado posiblemente por agentes neutralizantes inespecíficos (8). A pesar de que la toxicidad es una desventaja de la SN, en la experiencia realizada se presentó en niveles tan bajos que no llegó a impedir la lectura en ninguna de las muestras analizadas, esto demuestra la importancia de una adecuada preparación de los materiales utilizados en la sangría de los animales y en la realización de la prueba. A manera de conclusión sobre la prueba de SN, a pesar de las ventajas que exhibe la ELISA, incluyendo el no uso de células y la rapidez en su ejecución, la primera mantiene vigencia por su especificidad y por expresar en valores internacionales. AGRADECIMIENTO Se le agradece al Dr. Gustavo Morales, por su colaboración en el análisis estadístico de este trabajo. SUMMARY The detetion of antibodies to the pseudorabies virus were compared by mean of seroneutralization test (SN) and enzynle-tinked inmunosorbent assay (ELISA). Three hundred twenty seven sera were used for both tests. 172 (52.6%) were found to he positive for ELISA and 112 (43.3%) for SN. All sera that were negative for ELISA were also negative for SN. A weak positive group of sera was detected through ELISA but only 22% of them where positive by SN, indicating that no correlation was found between both test for this group of sera (r = 0.22 < 0.34) but, in contrast, in the positive sera groups by ELISA, 87% was detected by SN and for the strong positive sera groups 100% was detected, showing a very high correlation (r = 4.40 > 0.35). These results confirm the advantaje of the ELISA test over SN even though the latter is the reference test because of its high especificity and internacional value results. BIBLIOGRAFÍA 1. ANDERSON J., L. ROW and W. TAYLOR. Use of enzyme-linked inmunosorbent assay for the detection of IgG antibodies to rinderpest virus in epidemiological survey. Res. Vet. Sci. 34- 77-81.1983. 2. BANK, M. and S. CARTWRIGHT. Comparison and evaluation of for serological test for detection of antibodies to Aujeszky's disease virus. Vet. 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