|
Veterinaria Tropical 19: 83-90. 1994 COMPARACI�N DE LAS T�CNICAS DE SERONEUTRALIZACION Y ELISA PARA LA DETECCI�N DE ANTICUERPOS CONTRA PSEUDORRABIA Nelly Arriojas*, C�sar Obando*, A. Montoya* y Y. Cadenas* *FONAIAP
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RESUMEN Se
realiz� un estudio comparativo de las pruebas de Seroneutralinci�n (SN) y ELISA para la
detecci�n de anticuerpos contra el virus de Pseudorrabia porcina. Fueron procesados 327
sueros provenientes de una granja porcina ubicada en el estado Carabobo, en ambas pruebas
se obtuvieron resultados positivos en 172 sueros (52,6%) por ELISA y 112 sueros (34,3%)
por SN. Los sueros negativos por ELISA tambi�n resultaron negativos por SN. De los sueros
reconocidos como d�bilmente positivos por ELISA s�lo 22% fueron detectados por SN, lo
que indica que no hubo correlaci�n entre pruebas para este grupo de sueros (r = 0,22 <
0,34). Por el contrario, en los grupos de sueros positivos y positivos fuertes por ELISA,
la concordancia entre pruebas fue de 87% y 100%, respectivamente, mostrando una alta
correlaci�n INTRODUCCI�N La pseudorrabia, enfermedad causada por un herpesvirus (3), ha tomado importancia en la producci�n porcina ya que la intensificaci�n de la industria de cerdos ha favorecido la diseminaci�n del agente viral en las granjas. Esta enfermedad causa p�rdidas econ�micas cuantiosas debido a la mortalidad neonatal, problemas reproductivos y atraso de los animales (6). En aquellos animales infectados sin evidencia de la enfermedad, en condiciones de stress, ocurre reactivaci�n, reexcreci�n y diseminaci�n del virus, perpetuando la infecci�n en los reba�os (2). Por lo tanto, un requerimiento importante para el control o aplicaci�n de un programa de erradicaci�n es la disponibilidad de pruebas serol�gicas confiables y sencillas que permitan la detecci�n de animales que han tenido contacto previo con el virus. En la actualidad existen varias pruebas para la detecci�n de anticuerpos contra el virus de la Pseudorrabia (PRV), siendo las m�s recomendables la prueba lnmunoenzim�tica (ELISA) (2,5) y la Seroneutralizaci�n (SN) (11), por ofrecer ambas alta especificidad y buena sensibilidad. A pesar de que la prueba de ELISA es m�s sensible que la SN, esta �ltima es la prueba de referencia por ofrecer resultados en valores internacionales (6). En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue comparar la prueba de referencia internacional con la prueba de ELISA, en sueros. MATERIALES Y M�TODOS Para la realizaci�n de este trabajo fueron utilizados 327 sueros procedentes de una granja porcina ubicada en el estado Carabobo, de los cuales 212 correspond�an a cerdos vacunados y 115 a cerdos sin vacunaci�n. Cada uno de estos sueros se procesaron en forma doble por ambas pruebas. T�cnica de ELISA: para el desarrollo de esta prueba se utilizaron dos tipos de kit comercial*: ELISA SCREENING y ELISA VERIFICACION, este �ltimo para comprobar los resultados obtenidos por ELISA CREENING . Los sueros fueron procesados de acuerdo a las recomendaciones de la casa comercial. Para la interpretaci�n de la prueba ELISA los resultados se consideraron: negativos, d�bilmente positivos, positivos y positivos fuertes, tomando como referencia los valores de absorvancia de los Sueros controles respectivos, contenidos en el kit comercial (Cuadro l). T�cnica de Seroneutralizaci�n: para la realizaci�n de la prueba de SN, se, elabor� el ant�geno viral a partir de una cepa de Pseudorrabia aislada de un brote, a la cual se, le realizaron tres pases en la l�nea celular PK-15 y tres pases en la l�nea VERO, obteni�ndose un lote con t�tulo 10 4,6/ml DICC-50 en cantidad suficiente para el procedimiento de los sueros. Se confrontaron diluciones dobles de sueros problemas en medio de Eagle, desde 1:2 hasta 1:128, con 100 DICC-50 de ant�geno, por un per�odo de una hora a 37 "C. Seguidamente se adicion� suspensi�n de c�lulas VERO a una concentraci�n de 500 000 cel/ml m�s 10% de suero fetal bovino. Se incorporaron sueros positivos de referencia y sueros negativos, as� como control de unidades virales, c�lulas y sueros de campo. En cada prueba se incluy� una titulaci�n simult�nea para corroborar el n�mero de dosis infecciosas usadas. Todos los vol�menes se ajustaron a 50,al y la lectura de la prueba se realiz� despu�s de un per�odo de incubaci�n de 96 horas en estufa de C02, a 37 "C. Los resultados obtenidos por SN fueron comparados con los resultados obtenidos por ELISA, mediante el m�todo estad�stico de Coeficiente de Correlaci�n Biserial de Punto, con una confiabilidad de 99%. RESULTADOS Y DISCUSI�N Los resultados del procesamiento de 327 sueros de cerdos evidencian que la prueba de ELISA detect� 172 muestras con anticuerpos contra el VPR, en comparaci�n con la prueba de SN que reconoci� anticuerpos contra este virus s�lo en 112 sueros. Es importante se�alar que las muestras con resultados negativos por ELISA tambi�n lo fueron por SN y todas las muestras positivas por SN fueron positivas por ELISA (Cuadro 2). En la Figura se observa que s�lo 22% de los sueros reconocidos como d�bilmente positivos por la prueba de ELISA resultaron positivos por la prueba de SN, indicando que no hubo correlaci�n entre ambas pruebas, con relaci�n a este grupo de sueros (r = 0,22 < 0,34). No as� cuando se compararon los resultados de las pruebas en los grupos de sueros clasificados como positivos y positivos fuertes por ELISA, en donde la concordancia estuvo en 87% y 100%, respectivamente, indicando una alta correlaci�n (r = 0,40 > 0,35).
En relaci�n a los resultados de la prueba de ELISA y los t�tulos de anticuerpos detectados por SN se observ� lo siguiente: en los sueros d�bilmente positivos los anticuerpos neutralizantes variaron desde negativos hasta 1:4; en los positivos los t�tulos estuvieron en un rango desde 1:2 hasta 1:64 y en los positivos fuertes los t�tulos oscilaron entre 1:8 y 1:64, (Cuadro 3).
El resultado obtenido es determinante, la prueba de ELISA es mucho m�s sensible que la prueba de SN al reconocer 18,3% m�s animales con anticuerpos contra el VPR (Cuadro 2), hallazgo que ha sido se�alado en varios trabajos similares (2, 8, 9). Este hecho se explica, en parte, por la capacidad que posee la prueba de ELISA de detectar anticuerpos en animales primoinfectados, m�s temprano que la SN al reconocer diferentes clases de inmunoglobulinas (2,9). De manera adicional, es conocido que en algunos per�odos postinfecci�n los anticuerpos neutralizantes, inducidos mayormente por la glicoprote�na gIII del VPR (3), est�n en niveles no detestables por SN (4, 11), mientras que estos anticuerpos generados por otras estructuras antig�nicas del virus pudieran encontrarse en niveles detestables por ELISA (1, 10). Esto se corresponde con el incremento mostrado por los t�tulos de anticuerpos seroneutralizantes, en concordancia con los niveles ascendentes de positividad por ELISA (Cuadro 3). Desde el punto de vista pr�ctico esto explica el por qu� en reba�os infectados o en infecciones experimentales, los animales positivos �nicamente por ELISA, en una primera sangr�a, resultan positivas por ambas pruebas en una segunda sangr�a. A pesar del uso de m�todos estad�sticos adecuados para el establecimiento de un nivel de punto de corte en la prueba de ELISA, no se descarta la posibilidad de que con ella se puedan registrar falsos positivos. Un aspecto importante a considerar es que no se obtuvo resultados positivos por SN en ninguno de los sueros negativos por ELISA, lo cual ha sido se�alado por otros autores como ocasionado posiblemente por agentes neutralizantes inespec�ficos (8). A pesar de que la toxicidad es una desventaja de la SN, en la experiencia realizada se present� en niveles tan bajos que no lleg� a impedir la lectura en ninguna de las muestras analizadas, esto demuestra la importancia de una adecuada preparaci�n de los materiales utilizados en la sangr�a de los animales y en la realizaci�n de la prueba. A manera de conclusi�n sobre la prueba de SN, a pesar de las ventajas que exhibe la ELISA, incluyendo el no uso de c�lulas y la rapidez en su ejecuci�n, la primera mantiene vigencia por su especificidad y por expresar en valores internacionales. AGRADECIMIENTO Se le agradece al Dr. Gustavo Morales, por su colaboraci�n en el an�lisis estad�stico de este trabajo. SUMMARY The detetion of antibodies to the pseudorabies virus were compared by mean of seroneutralization test (SN) and enzynle-tinked inmunosorbent assay (ELISA). Three hundred twenty seven sera were used for both tests. 172 (52.6%) were found to he positive for ELISA and 112 (43.3%) for SN. All sera that were negative for ELISA were also negative for SN. A weak positive group of sera was detected through ELISA but only 22% of them where positive by SN, indicating that no correlation was found between both test for this group of sera (r = 0.22 < 0.34) but, in contrast, in the positive sera groups by ELISA, 87% was detected by SN and for the strong positive sera groups 100% was detected, showing a very high correlation (r = 4.40 > 0.35). These results confirm the advantaje of the ELISA test over SN even though the latter is the reference test because of its high especificity and internacional value results. BIBLIOGRAF�A 1. ANDERSON J., L. ROW and W. TAYLOR. Use of enzyme-linked inmunosorbent assay for the detection of IgG antibodies to rinderpest virus in epidemiological survey. Res. Vet. Sci. 34- 77-81.1983. 2. BANK, M. and S. CARTWRIGHT. Comparison and evaluation of for serological test for detection of antibodies to Aujeszky's disease virus. Vet. Rec.113:38 - 41.1983. 3. BEN-PORAT, T., M Dc MARCHI , B. LOMNICZI and A. KAPLAN. Role of glycoprotein of pseudorabies virus in eliciting neutralizing antobidies. Virology 154: 325 - 334. 1986. 4. CHU, H. S. Enzyme Linked Inmunosorbent assay for the detection of antobodies to bovine viral diarrhea virus serology. J. Vet. Mcd. 13 (33):354 - 361.1985. 5. GOYAL S. M., U. S. JOO, J. R. MOURNIGN, S. W. Mc PHERSON and K. GOYUAL. Comparison of three serotes for the detection of pseudorabies antibody in pigs. Comp. Immun. Microbiol. Infect. 10 (314):17-171.1987. 6. GUSTAFSON, D.P. Pseudorabies In: Disease of swine. Leman A. H. ed. Ames, I. A. Iowa State University Press. 6th ed. p. 274 - 288. 1986. 7. JOO H.S., A. D. MOLITOR and A. D. LEMAN. Radial immunodiffusion enzyme assay for detection of antibodies to pseudorabies virus imn swine serum. Amer. S. Vet. Res. 45 (10): 2096-2098.1984. 8. MOENNING Y., P. WOLDSENBET, H. R. FREY and B. LIESS. Comparative evaluation of ELISA and neutralintion test forthe diagnosis of Aujeszky's disease. Dtsch. Tierarzy Wschr 88: 51 - 56. 1981. 9. SHOENBAUM M., G. BERAN and D. MURPHY. A study comparing the immunologie responsos of swine to pseudorabies viral antigens, based on ELISA, serum virus neutr�lization and latex agglutination test. J. Vet. Diagn. Invest. 2:29 - 34.1990. 10. TODD, D., M. Mc. NAIR and J. E. Mc FERRAN. 1981 Enzymelinked inununosorbent assay for detecting antibodies to Aujeszky's disease virus in pigs. Veterinary Record 109 (2): 14 - 26. 1981. 11. WITTMAN G. 1986 Aujeszkys diseas. Rey. Sci. Tech off in Epiz. 5 (4):959 - 977.1986. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
