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Veterinaria Trop. 20:37-43. 1995. AISLAMIENTO
E IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD Carmen
de Noguera*, Dilia Infante*, Antonio J. León*, Nancy M. de
López*,
*FONAIAP. CENIAP. Instituto de
Investigaciones Veterinarias. |
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RESUMEN Se reporta el aislamiento de una cepa de campo del virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (EIB), de pollos de engorde con signos clínicos de la enfermedad. El aislamiento se realizó utilizando huevos embrionados SPF y pollos libres de anticuerpos contra EIB. La cepa se identificó usando la prueba de virus-neutralización con índice de 1,68 frente al antisuero variante A, y 0,68 con el standard. Se determinó índice infeccioso de la cepa, obteniéndose un valor de 105,25. Los pollos y los embriones presentaron lesiones macroscópicas y microscópicas que pueden relacionarse con las causadas por el virus. INTRODUCCIÓN El agente causal de la enfermedad infecciosa de la bursa (EIB) es un virus RNA de doble cadena (10, 11) de la familia Birnaviridae (5). Es responsable de inmunosupresión severa en aves expuestas durante las tres primeras semanas de edad. En aves de mayor edad puede ocasionar signos de la enfermedad, inmunosupresión transitoria o muerte (6, 15, 16). El virus fue aislado por primera vez en 1962, en Estados Unidos, por Cosgrove (3) y en Venezuela el primer aislamiento fue realizado por Quiroz et al., en 1979, de pollos de engorde de una granja del oriente del país (12). En los Estados Unidos se han identificado dos serotipos denominados I y II (9) de los cuales sólo el I es relacionado con la enfermedad en forma natural. En los últimos años se han señalado aislamientos de cepas diferentes o variantes al serotipo I (9); esta situación y la presencia de la enfermedad en lotes vacunados y con elevada inmunidad materna, ha sido causa de preocupación en la industria avícola (1,15,17). En Venezuela, durante la última década se han observado manifestaciones clínicas y lesiones macroscópicas y microscópicas en aves vacunadas que pudieran relacionarse con la enfermedad, lo cual hace pensar en la actuación de cepas diferentes a las usadas en las vacunas. El objetivo de este trabajo es el de intentar el aislamiento e identificación de una cepa del virus de la EIB diferente a las usadas en las vacunas. MATERIALES Y MÉTODOS En el Laboratorio de Patología Aviar del Instituto de Investigaciones Veterinarias CENIAP-FONAIAP se recibieron pollos de engorde de tres semanas de edad, vacunados contra la enfermedad de Newcastle a los ocho días, vía ocular, y contra la EIB a los 14 días por vía oral. Las aves presentaban plumas erizadas e incordinación, una morbilidad del 50% y mortalidad de 3,5%. A la necropsia presentaron regular estado de carnes, hígados necróticos, bazos hemorrágicos y bursas hipertrofiadas. Estas aves fueron identificadas en el Laboratorio con el número P=193. Muestras: se tomaron muestras de bursa, bazo y timo de las aves del brote natural (P = 5193) y de las aves infectadas experimentalmente. Aislamiento del virus y análisis histopatológico: las bursas fueron homogenizadas en una solución de caldo triptosa 1/5, con 10 000 UI/ml de penicilina y 10 000 μg/ml de estreptomicina, utilizando un mortero y arena estéril. Se centrifugó a 2 000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante fue inoculado sobre la membrana corioalantoidea (MCA) de embriones de 10 días, con una dosis de 0,10 ml; los cuales se incubaron durante siete días, llevando registros de mortalidad y lesiones. Con las MCA cosechadas al final del período de observación se realizaron cuatro pases en embriones. Se inocularon 10 pollos de engorde de tres semanas de edad, los cuales se habían mantenido en aislamiento hasta el momento de la exposición. Cinco pollos fueron inoculados por vía ocular con 0,05 mI en cada ojo y cinco pollos con 0,1 ml vía oral más 0,05 mI en cada ojo. Se mantuvieron cinco aves controles. Las aves fueron observadas durante seis días, llevando registros de signos clínicos y mortalidad. Al final del período de observación se necropsiaron para el estudio de lesiones macroscópicas y microscópicas y se pesaron las bursas, tanto de las aves controles como de las expuestas al virus. Identificación del virus: para la identificación del virus se usaron embriones libres de gérmenes patógenos (SPF), aplicando la técnica de virus neutralización (VN), descrita por Beard (2). Fueron utilizados sueros hiperinmunes standard y variante A, procedentes de la Universidad de Delaware. Título infeccioso del virus: para la determinación del título infeccioso del virus, se realizaron diluciones desde 10-1 hasta 10-7; se inocularon cuatro embriones de 12 días de edad por la MCA con 0,2 mI de cada una de las diluciones. El título del virus se calculó empleando el método de Read y Muench (2). Análisis histopatológico: para el estudio de lesiones microscópicas de tejidos, los mismos se fijaron en formalina al 10%. Los tejidos fijados fueron embebidos en parafina, cortados y coloreados con hematoxilina-eosina, usando técnicas convencionales. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las lesiones observadas en los embriones inoculados fueron los siguientes: MCA edematosas (26,5%), reducción de tamaño en los embriones (17,5%) y mal emplume (7,5%). Sólo en el IV pase se pudo observar hemorragias difusas localizadas en la parte posterior de la cabeza y cuerpo, más edema en cabeza y abdomen (25%) e hígado color verdoso con focos necróticos (30%). Los pollos inoculados por vía ocular presentaron a las 72 horas diarrea blanquecina (60%). Los inoculados por la vía oral y ocular presentaron diarrea blanquecina a las 72 y 96 h en un 20 y 60%, respectivamente. Las lesiones macroscópicas observadas en los pollos inoculados vía oral fueron: hemorragias petequiales en la masa muscular de la región femorotibial (100%), región interna de la masa pectoral torácica (60% ), bursa de Fabricio (20%) y hemorragia severa en tino (80%). Los pesos de las bursas oscilaron entre 0,4 y 1 g. En las aves inoculadas vía oral-ocular se observaron hemorragias petequiales en la masa muscular de la región femoro-tibial (80%); en la región interna de la masa muscular de la región pectoral (40%); hemorragias severas y congestión en timo (60%) y hemorragias petequiales y edema en bursas (60% ). Los pesos de las bursas oscilaron entre 0,6 y 0,9 g. Las aves controles no presentaron manifestaciones clínicas ni lesiones en órganos internos, con pesos de bursas entre 1 y 2,2 g. El estudio histopatológico de las aves inoculadas por vía oral reveló folículos linfoides disminuidos de tamaño, con fibrosis en el área cortical y en el espacio interfolicular; infIltración de linfocitos, monocitos y plas mocitos; necrosis de células linfoides caracterizada por picnosis, cariorrexis y focos hemorrágicos discretos en el área cortico medular de los folículos linfoides en 40% de las bursas. En el timo se observaron hemorragias discretas en la médula con signos de depleción linfocitaria. En el bazo, hiperplasia periarteriolar de células reticulares y depleción de los folículos linfoides. Las aves inoculadas por la vía oral-ocular presentaron lesiones similares a las anteriormente descritas, pero con más severidad, especialmente en la bursa de Fabricio, con mayor fibrosis interfolicular y presencia de cavidades quísticas en el área medular de los folículos linfoides. En las aves controles no se observaron lesiones de significación patológica en bursa, timo y bazo. En cuanto a la prueba de VN, la cepa neutralizada por el antisuero de EIB-variante A, con un índice neutralizante de 1,68, mientras que con el antisuero EIB-Standard se obtuvo un índice de 0,68. Estos valores indican que la cepa en estudio tuvo un índice de neutralización mayor cuando se enfrentó al antisuero variante A. El título infeccioso de esta cepa fue de 105.25 EID 50%. La única manifestación clínica observada (diarrea blanquecina) y las lesiones macroscópicas y microscópicas observadas en las aves expuestas, concuerdan con las descritas por otros investigadores (3,4,7, 17, 18). Las lesiones observadas en los embriones son similares a lo señalado por otros autores (13, 14). Por los resultados de la VN y las lesiones macroscópicas en los embriones, hacen presumir que la cepa aislada corresponde a una variante. El resultado de VN frente a un antisuero standard sugiere además la presencia de una población heterogénea de virus de EIB. Esto hace necesario estudios posteriores de purificación viral. Algunas investigaciones señalan una mayor inmunosupresión en pollitos durante la primera semana de vida, cuando está presente una cepa variante (4). Los hallazgos de cepas variantes, a nivel de campo, además de las cepas standard, complican los estudios epidemiológicos de la enfermedad, siendo necesario una revisión de los planes de vacunación y de las cepas vacúnales usadas en los mismos para el control de la enfermedad. SUMMARY Isolation of a field strain of infectious bursal disease virus (IBDV) from broilers chickens in reported. The isolation was made using SPF chicken embryos and IBDV antibody free chickens. The strain was identified by the virus-neutralization test, with 1.68 neutralizing index against variant A antiserum and a value of 0.68 with the standard. The infectious index of the strain was calculated obtaining a value of 105.25. Gross and microscopic lesions in chickens and embryos, were similar to that reported as produced by the IBDV. BIBLIOGRAFÍA
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