Veterinaria Tropical 21(1): 85-102. 1996

José E. Polanco* y Guillermo Comach**

  *Investigador. FONAIAP
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias
Instituto de Investigaciones Veterinarias
 Apdo. 70. Maracay 2101. Venezuela

** Profesor Universidad de Carabobo BIOMED. Núcleo Aragua
Recibido: Septiembre 15, 1995

RESUMEN 

Con la finalidad de probar las técnicas ELISA clásica y DOT -ELISA en el diagnóstico de la brucelosis, el antígeno crudo LPS-S se fijó en micro placas de polyestireno y en papel de nitrocelulosa y se enfrentó a diferentes muestras de suero. Se utilizaron en ambas pruebas 301 sueros porcinos de distintas granjas del estado Aragua, clasificados en tres grupos: Grupo I, 50 sueros de cerdos con evidencia clínica de brucelosis. Grupo II, 65 sueros sin evidencia clínica, pero reaccionantes con títulos bajos de anticuerpos. Grupo III, 186 sueros no reaccionantes a ninguna prueba y sin evidencias clínicas. Después de incubar con el conjugado anti-IgG porcino -peroxidasa, lavar y luego adicionar el sustrato, fueron considerados los sueros reaccionantes a una DO superior de 0, 153 para ELISA o la aparición de una mancha violacea sobre un fondo blanco en DOT -ELISA. La concentración óptima del antígeno fue de 50 ng para ELISA clásica, de 150 ng para DOT-ELISA y la dilución óptima del suero fue de 1:100 y 1:400, respectivamente. Los 301 sueros mostraron diferentes reactividad; en el Grupo I, ELISA clásica detectó anticuerpos en el 62% de los sueros y 52% en DOT -ELISA. En el Grupo II, ELISA clásica sólo detectó en el 6,2% de los sueros y en el Grupo III no se detectaron anticuerpos en ambas pruebas. La efectividad de los ensayos inmunoenzimáticos fueron comparados con las pruebas convencionales utilizadas en el diagnóstico de brucelosis, tomando como referencia la prueba de aglutinación en placa. La sensibilidad relativa para ELISA y DOT-ELISA en el Grupo I fue de 80% y 84%, mientras que la especificidad relativa fue de 56% y 80%, respectivamente. En el Grupo II hubo superioridad en la sensibilidad en las pruebas convencionales sobre las inmunoenzimáticas. 

Palabras Clave: Brucelosis; suinos; diagnóstico.

INTRODUCCIÓN 

La brucelosis porcina es una zoonosis de origen bacteriano causada por Brocella suis. Se caracteriza por afectar el aparato reproductivo, provocando aborto, retención de placenta, muerte embrionaria, repetición de celo, descarga vaginal, orquitis y disminución de la eficiencia reproductiva.

 El diagnóstico está basado en pruebas serológicas de seroaglutinación y de fijación de complemento, las cuales presentan dificultades para establecer un diagnóstico adecuado en animales recientemente infectados o en estado crónico, debido a su inespecificidad, estandarización y costo. 

Como alternativa ha surgido la técnica de ELISA que ha sido adaptada para un gran número de enfermedades (ENGVALL y PERLMANN, 1972), pero presenta como desventaja et alto costo en los materiales que utiliza (VOLLER et al., 1979). Debido a esto se ha desarrollado un sistema más simple y menos costoso, reemplazando sólo las placas de plástico que sirven de soporte por papel de nitrocelulosa. Esto se conoce como DOT -ELISA y es ampliamente aceptado por su gran versatilidad y rapidez (PAPPAS et al., 1983).

 Con el objetivo de evaluar el uso de las técnicas iomunoenzimáticas en el laboratorio y en el campo, en esta investigación se utilizaron ambas técnicas con la finalidad de detectar anticuerpos anti-Brucella en sueros porcinos, estandarizándolas bajo una serie de parámetros y comparándolas con las pruebas serológicas convencionales para el diagnóstico de la brucelosis porcina.

 MATERIALES Y MÉTODOS 

Preparación del antígeno

 La cepa de B. abortus lisa 1119-3, donada por el Laboratorio de Producción de Inmunobiológicos del Instituto de Investigaciones Veterinarias, fue utilizada para la obtención del antígeno (LPS-S). Se inocularon placas de agar triptosa y tubos con agar papa, los cuales se incubaron por 48 h a 37°C. A las 48 h se cosechó la bacteria con solución buffer (PBS, pH 6,4).

 Luego se inocularon en frasco de Roux con agar papa y paralelamente se chequeó la pureza y disociación de las colonias. Al término de 48 h a 37°C, se realizó la cosecha con buffer PBS más fenol al 0,5% y se centrifugó a 2.500 xg por 15-20 min, a 4°C.

Extracción del LPS-S

 Fue obtenido según el método Westphal descrito por BAKER y WILSON (1965), el cual brevemente se resume: 9,3 g del material antigénico obtenido fueron resuspendidos en 300 ml de agua destilada y en 300 ml de fenol al 90% y colocados en baño de María a 67-68°C en agitación vigorosa por 15 min. Luego fue enfriado y centrifugado a 2.500 x 9 por 45 min., a 4°C, obteniéndose una fase acuosa y otro fenólica. La fase fenólica fue filtrada mediante vacío en papel Whatman N°3 y al filtrado se le añadió tres volúmenes (150 ml) del reactivo metanol frío, y se agitó por 5-10 min. a 4°C. Posteriormente, el material obtenido fue centrifugado a 2000 x 9 por 15 min. y el precipitado obtenido fue resuspendido en 80 ml de agua destilada y dejado toda la noche en agitación a 4°C.

 Luego se realizaron tres lavados a 2.500 x 9 por 20 min., conservándose el sobrenadante de cada lavado. Los tres sobrenadantes en un pool fueron sometidos a diálisis con varios cambios de agua destilada, luego pervaporado a temperatura ambiente para un volumen final de 50 ml. Al producto resultante se le añadió dos volúmenes de metanol frío (120 ml), el cual fue dejado por 2 h a 4°C. El precipitado obtenido fue centrifugado a 2.500 x 9 por 15 min, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento resuspendido en 20 ml de agua destilada para su liofilización en alícuotas de 2  1 por frasco.

 Sueros 

Se utilizaron 301 sueros de porcinos de diferentes granjas del estado Aragua que fueron identificados por pruebas de aglutinación en placa (AP), en tubo (AT) y pruebas complementarias de 2-mercaptoetanol (2-ME) y card test (CT) y clasificados en tres grupos con los siguientes criterios: Grupo I: formado por 50 sueros de animales que presentaron evidencias clínicas de sufrir brucelosis, con historia de abortos, repetición de celo y nacimiento de animales débiles. Grupo II: constituido por 65 sueros de piaras que tenían antecedentes de animales reaccionantes con título bajo (1:25 y/o 1:50) a la prueba en placa, pero sin evidencia clínica de brucelosis. Grupo III: integrados por 186 sueros de animales no reaccionantes a ninguna prueba y sin evidencia clínica de brucelosis. 

Se usaron sueros controles positivos, negativos y para reactivos. Todos- los sueros fueron diluidos en forma seriada en PBS- TWEEN 20 al 0,05%.

Procedimiento para ELISA Indirecto (Clásico)         

Se utilizaron diferentes concentraciones de antígeno LPS en un rango entre 12,5 nanogramos y 100 ng/l00 µ l, preparados en buffer carbonato- bicarbonato 0,2 M (pH 9,6), colocados en los pozos de microplacas de polyestireno (96 Flat Botton well-Limbro- Titertek-Flow Lab. INC) e incubado por 1 h a 37°C y por 18 h a 4°C, luego las placas fueron lavadas con 300 µl de PBS- TWEEN 20 0,05%. Los pozos de la microplaca con el antígeno fueron bloqueados por 1 h a temperatura ambiente con solución PBS-Seroalbumina de bovino al 0,5%. Una vez eliminada la solución bloqueadora, las diferentes concentraciones de antígeno fueron enfrentadas a diferentes diluciones de sueros (1:50,1:100, 1:200) diluido en PBS- TWEEN 20 -0,05% por 1 h a temperatura ambiente. 

Las diluciones de sueros fueron aspirados y lavados tres veces con solución PBS- TWEEN -0,05%, después del lavado se agregaron 100 µ l del conjugado anti IgG porcina -peroxidasa diluido 1:2000 en PBS- TWEEN 0,05% (máxima dilución que recomienda la casa productora) por 1 h a temperatura ambiente, se repitieron los lavados con PBS- TWEEN -0,05% y por último se añadieron 100 µl del sustrato Orto-fenil-endiamina (OPD) en buffer citrato (pH 5) y H2O2 al 30% por 10, 15 y 20 min. Al finalizar el período de incubación se agregaron 50 µ l de H2SO4 ( 4N) para detener la reacción enzimática. Finalmente se leyó la densidad óptica (DO) producida por la reacción y coloración del cromógeno en un lector de ELISA (Titertek Multiskan) con 492 nm. 

Procedimiento para DOT -ELISA 

Se utilizaron diluciones seriadas del antígeno LPS (12-0,00024 , µg/microgota) preparados en PBS. Tiras de membrana de nitrocelulosa fueron divididos en pequeños cuadrados de 8 x 8 mm (BIO-RAD/LAB-CAT 162-0112) y sumergidas en agua destilada por 10 min y luego en PBS (pH 7,6) por 30 min. Las tiras fueron secadas al aire a temperatura ambiente, una vez seca se añadió al antígeno depositando 2 µl. Las tiras fueron procesadas a las 18-24 h o guardadas a 20°C para su posterior análisis. En cualquier caso, las tiras fueron bloqueadas con PBS- TWEEN 20 al 0,05% por 1 h en agitación continua, para luego dejar secar a temperatura ambiente. 

Posteriormente, 300 µ l de diferentes diluciones del suero (1:25 -1:3.200) fueron colocados sobre el cuadro de papel de nitrocelulosa con el antígeno en placas de cloruro de polivinil con excavaciones de 0,5 ml de capacidad, por 1 h a 37°C en agitación lenta; luego las tiras fueron lavadas 3-5 veces con PBS-TWEEN-0,05% y seguidamente 200 1 del conjugado anti-IgG porcina -peroxidasa diluida 1:2000 como en el ELISA clásico, fue agregado e incubado por 1 h a temperatura ambiente.

 Se repitieron los lavados con PBS- TWEEN-0,05% y se añadieron 200 µ l de la solución sustrato (4-cloro-naftol), que consistió de 3 mg de 4-cloro-1- naftol en metanol y diluido 1:3 en PBS (pH 7,6) más 151.11 de H₂O₂ (30%). El color desarrolló en 20 min y las tiras fueron lavadas con agua destilada, aspirando luego el contenido. La aparición de una mancha color violeta sobre un fondo blanco del papel de nitrocelulosa fue considerado como reaccionante en referencia al control negativo (sin mancha).

 Se determinó la efectividad de los métodos de diagnóstico utilizados en la brucelosis porcina, estimando la sensibilidad, especificidad y concordancia de cada una de las pruebas sobre sueros del Grupo I, tomando como referencia la prueba de aglutinación en placa y utilizando para su cálculo la tabla de contingencia de doble entrada (2 x 2). Los resultados obtenidos en cada método serológico fueron comparados con los obtenidos en la prueba de aglutinación en placa. 

El criterio de sensibilidad se estableció sobre la base del valor obtenido al medir la proporción de sueros reaccionantes provenientes de cerdos realmente infectados; para especificidad, se tomó el valor conseguido al medir la proporción de sueros no reaccionantes provenientes de cerdos que realmente no estaban infectados, y para concordancia, se estableció el valor expresado en términos de la proporción de menos reaccionantes y no reaccionantes que fueron detectados con cada uno de los métodos. 

Se consideró que un animal estaba infectado cuando por la prueba de AP resultaba reaccionante, además de provenir de granjas con animales con signos clínicos de una probable brucelosis. La sensibilidad, especificidad y concordancia fue calculada de acuerdo al estado de infección y al resultado de la prueba serológica evaluada con respecto a la prueba en placa, tomando en consideración los criterios de por RUPPANER et al. (1980) y MARQUEZ (1987) (Cuadro 1).

 RESULTADOS 

Determinación de la concentración óptima del antígeno y dilución del suero en ELISA clásica 

 Se observó que a medida que disminuía la concentración de antígeno, decrecían los valores de densidad óptima (DO). El mismo fenómeno ocurrió al aumentar las diluciones del suero. De todas las combinaciones utilizadas entre la concentración de antígeno y la dilución del suero, en la que se observó mayor diferencia entre el suero reaccionante y el suero no reaccionante fue en la concentración de 50 ng y dilución de 1:100, respectivamente, con una densidad óptica para el suero reaccionante de 1,002 y de 0,055 para el suero no reaccionante, siendo la diferencia 18 veces mayor el reaccionante que en el no reaccionante (Figura 1). La dilución del conjugado encontrado óptima fue de 1:2000. En todos los sueros no reaccionantes dio resultados negativos con todas las concentraciones de antígeno utilizadas.

 Con respecto a la reproducibilidad, 10 sueros reaccionantes a Brucella por las pruebas de aglutinación en tubo, 2-mercaptoetanol y card test se probaron tres veces y el nivel de reactividad no presentó cambios significativos entre los experimentos.

Determinación de la concentración óptima del antígeno y dilución del suero a utilizar en DOT -ELISA

 Concentraciones mínimas de 0,24 ng de LPS/microgota permitieron detectar IgG anti-Brucella en diluciones del suero reaccionante hasta 1:3.200. Sin embargo, la concentración óptima del antígeno que puede ser usado para detectar anticuerpos y donde se mantiene una mancha con igual intensidad de color, fue a la concentración de 0,15 µ g ya la dilución del suero 1:400, ya que a partir de ésta ocurrió un cambio drástico en la intensidad del color de la misma. Igualmente, con esta concentración óptima de 0,15 µ g/microgota pudo detectarse anticuerpos en diluciones de suero tan bajas como 1:102.400. La dilución del conjugado encontrada como óptima fue igual a 1:2.000. 

En todas las concentraciones de antígeno, con el suero no reaccionante, el resultado fue negativo y no se observaron reacciones inespecíficas en ninguna concentración. 

Para conocer la reproducibilidad, 10 sueros reaccionantes se probaron tres veces y el nivel de reactividad no presentó cambios significativos en cada experimento. 

La determinación del punto de corte para las pruebas de ELISA clásica fue de 0,153, todo suero por encima de ese valor fue considerado reaccionante. Para DOT-ELISA el punto de corte correspondió a la menor dilución del suero utilizado en la cual no hubo reacción ni con el suero reaccionante a bajo título ni con el suero no reaccionante. 

Los sueros del Grupo I analizados por los ensayos inmunoenzimáticos, pruebas convencionales y complementarias, mostraron diferente reactividad frente a cada uno de ellas; hubo sueros que resultaron reaccionantes a las seis pruebas utilizadas, en tanto que otras fueron negativos a todas produciéndose un gradiente intermedio con sueros reaccionantes a uno, dos, tres, cuatro o cinco métodos simultáneamente (Cuadro 2). En el Grupo II la reactividad fue diferente ya que hubo una mayoría de sueros, que resultaron reaccionates a dos pruebas y pocos a una prueba y tres pruebas (Cuadro 3). En el Grupo III no hubo reactividad en los sueros probados. 

En el Grupo I, la prueba de ELISA detectó anticuerpos en el 64% de los sueros probados, 52% por DOT -ELISA, 50% en la prueba de aglutinación en placa, 42% en tubo, 30% en 2 ME y 18% en card test. En el Grupo II, sólo ELISA detectó anticuerpos en el 6,2% de los sueros, en placa el 60% y en tubo el 56,9%; con DOT -ELISA, 2-ME y CT no se logró detectar anticuerpos en los sueros probados (Cuadro4).