Veterinaria Tropical 21(2): 129-143. 1996

ESTUDIO COMPARATIVO DE DOS MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LACTOPEROXIDASA

Marco Rampilli* y Nancy López**

* Investigador del Instituto Sperimentale Lattiero Caseario Lodi. Italia.
** Profesor Asociado. Universidad Central de Venezuela.
Cátedra de Salud Pública.
Facultad de Ciencias Veterinarias. Maracay 2101.
Edo. Aragua. Apdo. 4563. Venezuela.

Recibido: enero 30, 1996.

 RESUMEN

 Con el objeto de contar con un método preciso, que permita evaluar la lactoperoxidasa (LP) en la leche, enzima importante desde el punto de vista nutricional y tecnológico, se procedió a comparar y evaluar el método de Rothenfusser y el método de ABTS [2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic)acid]. El estudio se llevó a cabo en los laboratorios del Instituto Sperimentale Lattiero Caseario de Lodi, Italia, donde determinó LP en leche cruda entera y descremada y se evaluó la inactivación enzimática tanto en suero como en leche después de mantenerlas en refrigeración durante cuatro días. El mejor método para determinar LP es el ABTS a pH:5,5; pudiéndose expresar los resultados como actividad en unidades/mi, o como concentración en mg/l. Para expresar los resultados como concentración en mg/l no es necesario recurrir a curvas de calibración, ya que se determinó un coeficiente de 8,9 para leche entera y 9,27 para leche descremada, que multiplicado por la actividad permite obtener la concentración enzimática. Las concentraciones de LP en leche entera determinadas por el método ABTS a pH 5,5 fueron entre 24 y 41 mg/l (con actividades entre 2, 7 y 4,6 unidades/mi) yen leche descremada entre 21,97 y 39,86 mg/l (con actividades entre 2,37 y 4,3 unidades/mi).

 Palabras Clave: Leche; enzimas; métodos de ABTS y Rothenfusser . 

INTRODUCCIÓN 

Lactoperoxidasa (LP) es la enzima más abundante en la leche, después de la Xantina  Oxidasa. Las indicaciones bibliográficas sobre la concentración y actividad de LP varían de acuerdo al método usado para su determinación. Los primeros informes encontrados datan de 1953 (GROVES, 1971), en los cuales se señala concentración de 30 mg/1 en leche descremada WEBB et al (1974), informan sobre la actividad de l 22 000 UI°(UI: mMsustrato/min/100ml leche), sin especificar el método usado para su determinación, por lo (que dicho valor no puede ser comparable con los presentados por REITER, y HARNULV (1984), quienes indican valores de actividad de 1,4 Unidades/mI, usando el método de ABTS[2,2.-Azino-di(3-ethyl- benzthiazoline-6-sulfonic)acid]. 

BURLING et al (I990), señalan concentraciones de 20-25 mg/1 en suero de leche; PERRAUDIN (1991) encuentra concentraciones de 10-30 mg/1de leche y por último STANGA (1993), usando cromatografía liquida de alta presión, observó concentraciones variables de acuerdo a la raza 32,9 mg/l  para la raza Frisona Italiana y 36,8 mg/l para la Bruna Alpina.

 La concentración de LP es baja en el calostro, aumenta hasta alcanzar el máximo a los cinco días después del parto. disminuyendo luego para  permanecer más o menos constante por todo el período de lactación , (GROVES, 1971 y PERRAUDIN, 1991)

 LP pertenece al grupo de las oxidorreductasas y como tal cataliza las reacciones de oxidorreducción o de transferencia de electrones de un sitio de una molécula a otra.

Las oxidorreductasas catalizan la dehidrogenación de muchos compuestos orgánicos como fenol y aminas aromáticas, hidroquinonas, O-cresol, O-toluidina, guayacol, pirogalol, p-phenilendiamina y algunos otros derivados (PUTTER, 1974)

Las reacciones oxidativas consisten generalmente en dos pasos sucesivos (PUTTER, 1974} pero en presencia de iones halógenos y tiocianatos, tales, compuestos reaccionan con el donador en una fase única, con transferencia de dos electrones, para obtener el donador oxidado y regenerar la enzima nativa (BJORCK y MULLAN, 1983)

 Muchos son los métodos para determinar la concentración de LP en la leche, todos ellos basados en la propiedad oxidante de la enzima en presencia de peróxido de hidrógeno; la reacción se manifiesta colorimétricamente con la oxidación del donador de electrones el guayacol (LINDEN et al., 1982; PUTTER, 1974), la parafenilendiamina (AURAND et al., 1956), o una mezcla de ellos, lo que constituye el reactivo de Rothenfusser (PAGGI et al., 1984).

Muchas de estas sustancias no son estables en solución y son consideradas como cancerígenas o peligrosas para la salud, por lo que recientemente se ha sugerido la colocación de un nuevo donador de electrones, el ABTS [2,2'-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic)acid] (BJORCK y MULLAN, 1993). 

Son objetivos de esta investigación:

 Comparar el método de Rothenfusser (PAGGI et al., 1984), con el método de ABTS, sugerido recientemente por la Federación Internacional de Lechería [FIL] (BJORCK y MULLAN, 1993), igualmente medir la LP en leche entera cruda y descremada, así como en suero de leche y leche entera cruda, después de mantenerse en refrigeración durante cuatro días. 

MATERIALES Y MÉTODOS

 La investigación se realizó en los laboratorios del Instituto Sperimentale Lattiero Caseario de Lodi, Italia. Los reactivos utilizados en este trabajo tienen la especificación p.a (para análisis). 

Preparación de las muestras

Se utilizaron muestras de leche entera cruda y descremada, esta última obtenida mediante centrifugación de la leche entera a 3000 r.p.m por 10 min. Las muestras y/o patrones a evaluar por los métodos de Rothenfusser y ABTS, fueron acidificadas a pH 4,6 mediante la adición de HCl 2N, centrifugadas y filtradas a fin de obtener suero de leche.

Evaluación de los métodos de Rothenfusser y ABTS

Con el objeto de comparar los métodos de Rothenfusser y el de ABTS, se procedió en primer lugar a preparar curvas de calibración a fin de poder determinar la concentración enzimática, posteriormente fueron preparados t muestras de leche entera y descremada a las cuales se les aplicó los mismos , métodos.

A fin de obtener las curvas patrones para los dos métodos bajo estudio, fue necesario calentar la leche entera cruda y descremada a 90°C por 5 min, con el objeto de inactivar la enzima nativa. Después de enfriada se elaboraron patrones con LP Sigma L-2005, en concentraciones entre 2,5 y' 40 mg/1 que se sometieron a los métodos de estudio. 

MÉTODO DE ROTHENFUSSER

Reactivos: 

(SIGMA CHEMICAL Company. Analisi  delláattivatá enzimatica della Lattoperossidasi L-2005. Comunicación personal). Tampón fosfato pH:6,8: Disolver 35,61 g/1 de Na₂ HPO₄.2H₂0 (a) y 27,60 g/1 de NaH₂ PO₄.H20 (b). Adicionar a 49 ml de la solución (a) 51 ml de la solución (b ), y llevar a 200 ml con agua destilada. 

Reactivo de Rothenfusser: 

Agregar a una solución de 19 de clorhidrato de parafenilendiamina disuelta en 15 ml de agua destilada, una solución de 2g de guayacol diluido en 135 ml de alcohol etílico al 96%. Conservar en refrigeración en botella oscura. 

(SIGMA CHEMICAL Company. Analisi  delláattivatá enzimatica della Lattoperossidasi L-2005. Comunicación personal). Solución de H₂O₂ al 1 %: En un balón aforado de 100 ml colocar 3 ml de H₂O₂ a135% y enrasar con agua destilada. En una cubeta de vidrio óptico colocar: 3 ml de tampón fosfato; 30. ml de suero; 250.ml de reactivo de Rothenfusser y 50.m1 de H₂O₂ al 1 %. Agitar y leer en el espectrofotómetro en términos de absorvancia a 540 nm, a los 2 min de la adición de los reactivos contra un blanco en el cual no se adiciona la muestra.

 MÉTODO ABTS. 

Reactivos:

(SIGMA CHEMICAL Company. Analisi  delláattivatá enzimatica della Lattoperossidasi L-2005. Comunicación personal).Tampón acetato pH:4,4. Disolver 8,2 g/1 de acetato de sodio en agua destilada y llevar a pH:4,4 con ácido acético al 10%. 

(SIGMA CHEMICAL Company. Analisi  delláattivatá enzimatica della Lattoperossidasi L-2005. Comunicación personal).Tampón fosfato pH:5,5. Disolver 13,61 g/l KH₂PO₄ (a) y 22,82 g/l K₂HPO₄.3H₂O (b). A 50 ml de la solución (a) agregar solución (b) hasta obtener pH:5,5.

(SIGMA CHEMICAL Company. Analisi  delláattivatá enzimatica della Lattoperossidasi L-2005. Comunicación personal).Solución ABTS lM: Disolver 55 mg de ABTS en tampón acetato pH:4,4 y en tampón fosfato pH:5,5 y llevar a 100 ml. 

(SIGMA CHEMICAL Company. Analisi  delláattivatá enzimatica della Lattoperossidasi L-2005. Comunicación personal).Solución H₂O₂ 5 mM: En un balón aforado de 100 ml adicionar 45ml de peróxido de hidrógeno al 35% y enrasar con agua destilada. La concentración de esta solución es controlada a 240 nm contra agua destilada. La absorvancia debe ser 0,22 ±0,01.

Este método fue realizado en dos modalidades: usando ABTS en tampón a pH:4,4, tal como lo describe la FIL (BJORCK et al., 1990), así como ABTS en tampón a pH:5,5, tal como lo indica el protocolo Sigma, para medir la actividad de LP pura. 

Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de la solución sustrato de ABTS, agregar 25ml de suero ácido y agitar. Dividir en dos porciones de 2,5 ml cada una y colocarlas en dos cubetas del espectrofotómetro, una de las cuales constituye el blanco. En la otra se adiciona 50 ml de H₂O₂ 5 mM, se mezcla y se mide la absorvancia a 413 nm cada minuto durante 5 min.

 La actividad de la enzima se calculó por la fórmula:

Donde:

DA₄₁₃: incremento de la absorvancia/ min 
5: volumen del sustrato (ml)
32,4: Coeficiente de extinción a las condiciones descritas
0,025: cantidad de muestra (ml) 

A fin de determinar cual de los métodos objeto de este estudio arroja resultados más confiables, se procedió a aplicar los mismos en muestras de leche esterilizada entera y descremada adicionadas de LP a las concentraciones de 5-10y20 mg/l.

Determinación de la enzima lactopernxidasa en teche entera cruda y en leche descremada

Los métodos bajo estudio fueron aplicados en muestras de leche cruda, entera y descremada a fin de determinar la LP, su actividad y concentración, en leche entera cruda y en leche descremada.

 Medición de la actividad de lactoperoxidasa en leche y suero ácido después, de su almacenamiento en refrigeración durante cuatro día.

Con el objeto de evaluar la eventual inactivación de LP, se procedió a esterilizar la leche a fin de inactivar la enzima nativa y para luego adicionar LP en diversas concentraciones.

Estas muestras fueron dividida, en dos, partes de una de ellas se obtuvo suero ácido el cual fue mantenido en refrigeración pm 4 días al igual que la muestra completa. Determinándose la concentración enzimática al tiempo de preparación de las muestras, y a los 4 días usando el método ABTS a pH:5,5

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

Evaluación de los métodos, de Rothenfusser y ABTS

Los datos obtenido, para la elaboración de la, curvas patrones fueron , sometidos, a análisis de regresión, obteniéndose 100 mejores coeficientes de correlación para el método de Rothenfusser (Cuadro 1).

Dado que existían discordancia, entre el pH del , sustrato utilizado en el método de ABTS, descrito por la Federación Internacional de Lechería (BJORCK et al 1993), y aquel señalado en el protocolo de Sigrna en el método usado para determinar la actividad enzimática, se procedió a evaluar el método usando los dos pH, para lo cual se elaboraron patrones de LP en leche entera y leche descremada 

Los resultados obtenidos (Cuadro 2) muestran una diferencia entre la leche entera y la leche descremada MULLAN et al.(1980) hacen referencia a una repartición entre la fase grasa y la fase acuosa; sin embargo, esta explicación no puede ser aplicada a este caso, ya que primero se procedió al descremado de la leche (3 000 rpm x 15') y sucesivamente se adicionó LP en solución. Es probable que puedan existir factores asociados a la fase grasa, que favorecen la actividad de la LP. Fue observada una actividad enzimática mayor a pH:5,5 que a pH:4,4.

Los dos métodos fueron aplicados a muestras de leche (entera descremada) calentadas a 80°C por 2 min a fin de inactivar la enzima nativa, posteriormente enfriadas y luego se les adicionó diferentes concentraciones de la enzima, obteniéndose resultados diferentes entre la leche entera y la descremada cuando se aplica el método de Rothenfusser; con el método ABTS esta diferencia es poca (Cuadro 3).

Con los resultados obtenidos sobre 33 muestras cuando se aplicó el método ABTS, fue posible encontrar un coeficiente de conversión de 8,9 para leche entera (con una desviación estándar de 0,005) y de 9,27 para leche des cremada (con una desviación estándar de 0,0043), que al multiplicarse por la actividad expresada en unidades/ml permite obtener la concentración de la enzima en mg/l sin necesidad de recurrir a curvas de calibración. 

Determinación de la enzima lactoperoxidasa en leche entera cruda y en leche descremada

Los métodos de Rothenfusser y ABTS (pH:5,5) se aplicaron sobre muestras de leche cruda entera y descremada, a fin de determinar la actividad enzimática y la concentración, (Cuadro 4), encontrándose concentraciones mayores de la enzima en leche entera que en leche descremada; , estos resultados son acordes con los señalados por MULLAN et al. (1980) ! y la explicación de la repartición de la enzima entre la fase grasa y la acuosa.  

Se evidenciaron resultados mayores cuando se aplicó el método ABTS que cuando fue empleado el método de Rothenfusser, lo cual es avalado por diversos autores (BURLING et al. , 1990; GROVES, 1971; MULLAN et al., 1990; REITER y HARNULV, 1984) cuando expresan que no se pueden comparar resultados obtenidos por diversos métodos. 

REITER y HARNULV (1984) señalan valores de actividad de la enzima de 1,4 unidades/ml, usando el método ABTS; tales autores no especifican el pH utilizado en la determinación, lo cual puede explicar la diferencia con los resultados obtenidos en este trabajo (3,64 unidades/ml para leche entera y 3,33 unidades/mI para leche descremada), trabajando a pH:5,5.

Determinación de lactoperoxidasa en leche entera y suero de leche después de su almacenamiento en refrigeración por cuatro días. 

Los resultados obtenidos en el suero ácido (Cuadro 5) muestran siempre inactivación enzimática, lo cual está de acuerdo con los estudios de MULLAN et al. (1980), respecto a la inestabilidad de la enzima en suero de queso, con pérdida de actividad del 50%, después de almacenadas a 5°C por 3 días.

 En el caso de muestras de leche se observan resultados discordantes (Cuadro 6), en algunos casos se nota inactivación mientras que en otros aparenta una actividad superior.

SCRARWZ y SYDOW (1954), señalan que la inactivación de LP es mayor en leche no muy fresca y refieren que la acidez de la leche no causa una inactivación más intensa.

WRIGTH y TRAMER (1958) mencionan inactivación de la enzima a temperaturas de 87°C, debido a la presencia de grupos SH, desarrollados durante el tratamiento calórico. Tal planteamiento puede explicar la inactivación observada en algunas muestras, ya que el calentamiento de la leche fue realizado a temperaturas entre 80-90°C, sin un control muy estricto de la misma. 

Respecto a los fenómenos de reactivación, WRIGTH y TRAMER (1958) asocian estos procesos a la adición de cisteína y tiosulfato de sodio; GROVES (1971), señala que en algunos casos LP es regenerada después de períodos de conservación de la leche. 

WOERNER (1961) hipotetiza que el proceso de reactivación es un proceso químico-coloidal, en el cual la caseína puede actuar como un coloide protector, siempre que el daño térmico no sea muy elevado. 

 CONCLUSIONES 

• Los mejores resultados para determinar la actividad y/o concentración de la enzima LP se obtienen usando el método ABTS con pH:5,5. 

• El método de Rothenfusser tiene como ventaja el tiempo requerido para hacer el análisis, pero tiene la desventaja de necesitar siempre una curva de calibración, tanto para leche cruda como para la descremada, a fin de determinar la concentración. 

• En relación con los valores obtenidos en leche cruda y descremada, cuando se usa el método ABTS a pH:5,5, las concentraciones varían entre 24 y 41 mg/1 para leche entera (con actividades entre 2, 7 y 4,6 unidades/mi), y concentraciones entre 21,97 y 39,86 mg/l (con actividades entre 2,37 y 4,3 unidades/mi) para leche descremada. Con el método de Rothenfusser, las concentraciones obtenidas varían entre 20-37,35 mg/l en leche entera y de 16,4 a 28,2 mg/1 en leche descremada. 

• Se verificaron procesos de inactivación en el caso de suero ácido refrigerado por 4 días, y procesos de inactivación así como de reactivación en el caso de leche refrigerada por 4 días.

• Los fenómenos de inactivación son probablemente debido, a la formación de grupos, SH durante el proocesode calentamiento de la leche, mientras, que los proceso de reactivación observados después del almacenamiento ,refrigerado de la leche pudiesen explicarse a través de la teoría de WOERNER.

SUMMARY

Since lactoperoxidase is an important enzyme from the nutritional and technical standpoint, the Rothenfusser and ABTS [2,2'-Azino-di(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic)acid] methods were compared in order to be able o rely on an accurate proceedure to evaluate it. Lactoperoxidase in raw vhole and skim milk was determined and the enzymatic inactivation in the vhey and milk, after four days of refrigeration, was evaluated. Of the two nethods studied the ABTS pH:5.5, was found to the better one. The results vere expressed as unit activity/ml or as concentration in mg/l. To express the esults as concentration in mg/1 it was not necessary to use calibration curves Because an 8.9 coefficient was determined for whole milk and 9.27 coefficient or skim milk. These coefficients multiplied by the activity allowed us to obtain the enzymatic concentration. The concentrations of lactoperoxidase in whole milk determined by the ABTS method with a 5.5 pH were between 24 and 41 mg/1 (activity being between 2.7 and 4.6 units/ml). For skim milk he value of peroxidase was between 21.97 and 39.86 mg/l (activity being between 2.37 and 4.3 units/ml). 

Key Words: Enzymes; methods; ABTS and Rothenfuser.

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