José Polanco* , Liliana de Aguirre *.Eudis Marcano** y Aldays Pantoja**

                                                                                                                 ¹ Trabajo financiado.por FUNDACITE-Aragua.
             *FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias. Apdo. 70. Maracay 2101. Venezuela.
**Universidad de Carabobo. Escuela de Bioanálisis.
 Recibido: Enero 22, 1996.

 RESUMEN

 Se compararon las técnicas de Aglutinación Microscópica (AM) y DOT-ELISA para el diagnóstico de leptospirosis humana, utilizando para ello la Leptospira biflexa, serovar Patoc I, un antígeno apatógeno, y 181 sueros de humanos provenientes de pacientes con sintomatología compatible a leptospirosis en hospitales de los estados Aragua y Carabobo, y 20 sueros de humanos saludables, como control. Cuarenta y nueve sueros resultaron positivos con la prueba de AM y 47 de esos sueros fueron reactores en DOT -ELISA; 26 para anticuerpos específicos a IgM° 3 para IgC específico y 18 para ambos. El resto de los sueros resultaron negativos con la prueba de AM y 71 fueron reactivos en DOT-ELISA. De estos últimos 44 reaccionaron a IgM; 19 tuvieron combinación de anticuerpos específicos IgM e IgC y sólo 8 a anticuerpos específicos a IgC. Los sueros positivos a AM fueron reactores a diferentes serovares asociados a enfermedades en el hombre y animales, siendo los más frecuentes hardjo, icterohaemorragiae, hebdomadis, bratislava, pomona, canicola y grippothyposa, todos ellos reactores en DOT -ELISA; obteniéndose mayor reactividad, con títulos de hasta 1: 12.800, de los sueros positivos a hardjo e icterohaemorragiae. Solo ocurrió una reacción positiva en el DOT -ELISA entre los 20 sueros control, sugiriendo que hubo previa exposición de uno de los pacientes. Estos resultados indican que la prueba DOT -ELISA, utilizando anti-IgM específico, es más sensible para el serodiagn6stico de leptospirosis aguda; además de ser uno prueba rápida, económica y simple de ejecutar, pues utiliza pequeños volúmenes de antígeno y de reactivos.

 Palabras Clave: Leptospirosis; Leptospira biflexa; diagnóstico; zoonosis. 

INTRODUCCIÓN 

La leptospirosis es una enfermedad febril aguda, de carácter zoonótico, que afecta una gran variedad de animales domésticos, salvajes y al hombre. En este último la enfermedad varía en cuanto a su severidad: desde una forma benigna que puede ser subclínica, hasta la forma más severa que generalmente es fatal (FAINE, 1982).

 El diagnóstico de leptospirosis depende primordialmente de la detección de anticuerpos específicos por la prueba de aglutinación microscópica (AM), utilizando antígenos vivos (GALTON et al., 1965). En años recientes, a nivel de clínica y hospitales, se trabaja en la búsqueda de una prueba simple, sensible, específica y rápida; nuevas técnicas como el uso de los sistemas inmunoenzimáticos (ELISA-DOT ELISA) han sido señalados como efectivos (ENGUALL y PERLMANN, 1972; PAPPAS et al., 1985; WATT et al., 1988).

 Actualmente, la prueba de AM es el método serodiagnóstico de escogencia. Este ensayo utiliza una batería de distintos serovares, los cuales son incubados con el suero del paciente y visto bajo un microscopio de campo oscuro para observar aglutinación o lisis; sin embargo, esta prueba es costosa en cuanto a material técnico y requiere de mantenimiento de cultivos de serovares vivos, factores estos que limitan su uso en muchos laboratorios (MYERS, 1985). 

DOT -ELISA es una nueva técnica en la cual se utilizan pequeñas cantidades de antígeno que colocadas sobre discos de papel de nitrocelulosa reaccionan con sustrato cromogénico precipitable. Su lectura se hace visual sobre un fondo blanco en corto tiempo (2 h), los reactivos se conservan y se usan en pequeñas cantidades, la sensibilidad y especificidad es equivalente a la ELISA standard (PAPPASet al.., 1985; SHI, 1992), por lo que es posible su utilización para establecer un diagnóstico de leptospirosis en la fase inicial de la enfermedad y de buscar la automatización de la técnica para estudios masivos en el país. 

Con el objetivo de utilizar la técnica DOT -ELISA como una alternativa en el diagnóstico de la leptospirosis humana, se realizó este tr¡ibajo, que pudiera servir de base para estudios futuros, en gran escala, con poblaciones de alto riesgo a la enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

 Un total de 181 sueros humanos provenientes de pacientes de hospitales de los estados Aragua y Carabobo, con sintomatología compatible con leptospirosis, fueron remitidos al Laboratorio de Leptospirosis del Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP) y 20 sueros adicionales de personas saludables, sirvieron como control. Los sueros se distribuyeron en pequeñas alícuotas de 200 µ1 y guardados a -20 °C. Se usaron sueros controles positivos obtenidos del Instituto Nacional de Higiene.

 La Leplospira biflexa apatógena, serovar Patoc I, obtenida por el método de extracción con etanol frío fue usada como antígeno en el DOT -ELISA (COX, 1955; PAPPAS et al., 1985). Esta cepa se desarrollo en medio de E.M.J .H., a 23 °C, en la oscuridad, donde se obtuvo una concentración de 108 organismos /µ1 (entre 10-14 días) (MYERS, 1985).

 El cultivo de leptospira fue preparado como se describe a continuación: se aplicó 0, 75 mg de azida de sodio a 1,5 l del cultivo y se centrifugó a 4.500 rpm por 45 min; el sobrenadante fue descartado y el precipitado resuspendido en 32 µ1 de una solución de cloruro de sodio 0,15 M y un volumen igual de etanol absoluto frío 50% V / V .A la solución prerefrigerada toda la noche, se le agregó etanol frío hasta llevarlo a una solución al 90%; posteriormente se refrigeró por 6 días. El precipitado fue removido por centrifugación a 2.400 rpm 1 h y el sobrenadante descartado. El precipitado fue suspendido en 30 µ1 de agua destilada, luego se repartió en alícuotas de 2 µ1 las cuales se conservaron a -20 °C hasta su uso en DOT -ELISA. La determinación de proteína de este antígeno se hizo por el método de Biuret (GARVEY et al., 1977).

 Para la prueba de aglutinación microscópica (AM) se utilizó una batería de nueve serovares viables, asociados con la enfermedad en animales y el hombre: icterohaemorragiae, canicola, pomona, hardjo, hebdomadis, ballum, bratislava, grippotyphosa y pyrogene. Los cultivos vivos de siete días fueron mantenidos en medios de E. M. J. H. a una concentración de 10⁸ leptospiras / µ1. 

Los sueros problema se diluyeron (1:50) en solución salina y se sometieron a una prueba pantalla en microplacas de polivinil (96 flatbotton wells microtest III. Falcón 39121) en cuyos pozos se colocaron 100 µ1 del suero diluido y 100 µ1 del antígeno estandarizado, quedando la dilución en 1:100.

Se concluyó un control con 100 µ1 de solución salina y 100 µ1 del antígeno. Las microplacas fueron incubadas durante 2 h a temperatura ambiente. Cada pozo fue examinado en un microscopio de campo oscuro (Zeiss 160X) para ver aglutinación o tisis. A los sueros que presentaban reacción positiva a la dilución 1:100 se les realizó extensión de títulos al respectivo serovar para determinar el punto del título de aglutinación, la cual fue la más alta dilución que dió 50% o más de aglutinación de leptospiras (MYERS, 1985). 

El procedimiento de DOT -ELISA fue aplicado para la detección de anticuerpos contra leptospira según el método descrito por PAPPAS et al. (1984) con algunas modificaciones. Se procedió de la siguiente manera: los discos de nitrocelulosa se colocaron en agua destilada por 10 min y luego (1.600 ng de proteína) en PBS (pH 7,4) por 15 min; una vez secos, 2 µ1 del antígeno fueron adsorbido sobre discos de papel de nitrocelulosa (8 x 8 mm) y guardados a 4 °C hasta su uso. 

Los discos con el antígeno se colocaron en pozos de microplacas de polivinil con capacidad de 0,5 µ1; los espacios libres de antígenos fueron bloqueados con 300 µ1 de PBS- TWEEN 20 al 0,2% por 3-5 min en agitación lenta. Luego de aspirar la solución de bloqueo, 300 µ1 de diluciones de cada suero, de 1:25 hasta 1:400 en PBS- TWEEN, al 0,5%, fueron añadidos a cada pozo, agitando por 1 min e incubado por 30 min a temperatura ambiente. 

Los pozos se lavaron cuatro veces con 300 µ1 de PBS- TWEEN 0,05% por 1-2 min y luego se agregaron 300 µ1 de diferentes diluciones (1:300 -1:500) del conjugado anti IgM humano con peroxidasa (SIGMA LOTE-E03) o anti IgG humano conjugado a peroxidasa (SIGMA), diluido en PBS- TWEEN 20 al 0,05%. Los sueros fueron incubados por 30 min a temperatura ambiente y posteriormente lavados; se añadieron 300 µ1 a cada pozo del sustrato (4-cloro-1 naftol) diluido en cantidades óptimas de metanol-PBS (pH 7,4) más 15 µ1 de agua oxigenada al 30% por 20 -30 min. Una vez finalizada la incubación se agregó agua destilada tres veces, aspirándose luego el contenido y leido como reacción positiva al aparecer claramente como una mancha de color violácea sobre el fondo del papel de nitrocelulosa. 

Los datos fueron analizados usando la prueba de Mc NEMAR para análisis estadístico, con nivel de significancia de P£0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 Para la determinación de la concentración óptima del antígeno se utilizaron sueros humanos reaccionantes con altos títulos y sueros negativos de pacientes sanos. En el Cuadro 1 se presenta el diseño que se utilizó rara establecer la concentración óptima del antígeno. Para ello se utilizaron diferentes concentraciones del antígeno Patoc I entre un rango de 200 ng hasta 3.200 ng, los cuales fueron enfrentados a diferentes diluciones de los sueros (1:25-1:400), mantenida la dilución del conjugado anti IgM e IgG peroxidasa en 1:300 y luego a 1:500.