Veterinaria Tropical. 22(2): 189-194. 1997

NOTA

SOBREVIVENCIA DEL Trypanosoma vivax (cepa I IV) y Trypanosoma evansi (cepa TEVAl) 
EN CONDICIONES EXPERIMENTALES

Emir Espinoza*, Nersa Gonz�lez**, Gisela Primera***, Marc Desquesnes**** y Lu�s Hidalgo**

*Investigador. Centro de Investigaciones Agropecuarias del estado Gu�rico. Carretera
Nacional v�a Calabozo. Apure. Edo. Gu�rico.
**Profesores. Universidad Sim�n Rodr�guez (Rectorado) Apdo. 3690 y Universidad
Sim�n Bol�var (Bioterio) Apdo. 89000, respectivamente. Caracas 1010. Venezuela.
***Profesora. Universidad Central de Venezuela. Post-Grado. Facultad de Ciencias
Veterinarias. Maracay 2103, estado Aragua. Venezuela.
****Institut Pasteur, Guyane Francaise. RECIBIDO: mayo 26, 1997.

RESUMEN

El prop�sito de esta comunicaci�n es informar sobre las modificaciones en el m�todo de congelaci�n de Trypanosoma vivax realizado por Espinoza y Tortolero, estas se basaron en el reemplazo del  PBS por el medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma). La viabilidad, infectividad y patogenicidad de los T. vivax y Trypanosoma evansi fueron satisfactorias para los estudios experimentales. Adem�s, podr�a permitir el traslado al laboratorio a un menor costo, en un per�odo de 48 horas, de muestras sangu�neas tomadas en el campo, al sustituir el nitr�geno l�quido por hielo seco.

Palabras Claves: Trypanosoma; RPMI 1640; conservaci�n; hielo seco.

INTRODUCCI�N

Desde finales de la d�cada de 1980 se ha propagado en el pa�s de mayor inter�s por el estudio de la tripanosomiasis animal, causada por Trypanosoma vivax y Trypanosoma evansi, situaci�n que va a la par con las motivaciones sobre el tema por parte de otros investigadores en el continente americano tropical y sub tropical (VOKATI et al., 1993; RIVERA, 1996).

En Venezuela, la atenci�n ya no s�lo se centra en la ganader�a bovina, sino tambi�n en las explotaciones equinas, ovinas, caprinas e inclusive las no dom�sticas (GARCIA, 1988; ARIAS, 1993; SANDOVAL et al., 1996; MAVARE et al., 1996). No obstante, la conservaci�n y transporte a bajas temperaturas del T. vivax americano tiene la reputaci�n de ser inestable. Las t�cnicas de mantenimiento que se usan para este hemopar�sito, tal como su multiplicaci�n en peque�os rumiantes y la criopreservaci�n en nitr�geno l�quido, actualmente, son muy costosas.

Por lo tanto, el objetivo de esta comunicaci�n es informar sobre los per�odos de sobrevivencia obtenido de manera experimental en aislados venezolanos de T. vivax (cepa IIV) y T. evansi (cepa TEVAI), basado en algunas modificaciones de conservaci�n, preservaci�n y transporte de Trypanosoma sp, realizadas anteriormente por ESPINOZA y TORTOLERO (1990) para su uso en investigaciones cl�nicas, diagn�sticas, epidemiol�gicas, reproductivas y de resistencia a drogas, tanto en Venezuela como en la Guyana Francesa (DESQUESNES y TRESSE, 1996a).

MATERIALES Y M�TODOS

El procedimiento de criopreservaci�n se realiz� manteniendo en su mayor parte el protocolo descrito por ESPINOZA yTORTOLERO (1990), modificando el paso I, al reemplazar la soluci�n amortiguadora (PBS) por un medio de cultivo, en este caso RPMI 1640, sin a�adirle bicarbonato de sodio, ni antibi�tico, y la eliminaci�n del paso 2. De tal manera, el protocolo qued� como se describe a continuaci�n:

• Se prepara una soluci�n del medio de cultivo, RPMI 1640 (1 frasco o papeleta, Sigma) en 11 de agua destilada.

• Se elabora una mezcla crioprotectiva basada en dimetil sulf�xido (DMSO ) al 10%, contenida en la soluci�n preparada en el paso 1. (1volumen de DMSO en 9 vol�menes de RPMI).

• Se toma sangre infectada de un rumiante extra�da de la vena yugular, o un donante roedor, v�a intracard�aca, infectados experimentalmente, en el momento pico de la parasitemia

• El crioprotectivo DMSO al 10% se mezcla volumen a volumen con la sangre infectada, de modo que la diluci�n final quede al 5%.

• A continuaci�n la mezcla (sangre infectada + DMSO) se coloca en viales crioprotectivos de 1 ml, protegido con papel de aluminio, y se sumergen en el fondo del tanque de nitr�geno l�quido.

RESULTADOS Y DISCUSI�N

Al d�a siguiente del proceso de congelaci�n, una muestra del material estabilizado se descongel� mediante la colocaci�n del vial en un recipiente con agua a temperatura ambiente, seguidamente se efectu� la valoraci�n del mismo en un per�odo de revisi�n a intervalos de 6, 12, 24, 36 y 48 h, manteniendo siempre el estabilizado en hielo. Indistintamente, del tripanosoma evaluado (T. vivax o T. evansi), la viabilidad de los mismos fue considerada subjetivamente satisfactoria, cuando a las 24 h no se observ� reducci�n en la masa de par�sitos de las muestras analizadas en el portaobjeto a trav�s del microscopio de luz. Sin embargo, a las 36 h fue notado en el estabilizado de T. vivax una reducci�n en un 30% ya las 48 h una disminuci�n en la masa parasitaria, estimada en menos del 50%.

El estabilizado de T. evansi, a las 36 y 48 de examinado present� mayor porcentaje de sobrevivencia. Despu�s del lapso del ensayo, el material congelado fue considerado no viable al no poderse detectar tripanosomas vivos o al ser muy escasa su presencia.

EKWURUKE et al. (1985) encontraron en sangre de ovejas y cabras infectadas con T. vivax, que antes de las 24 y 26 h, respectivamente, el n�mero de par�sitos permanec�a constante, y por lo tanto infirieron que en peque�os rumiantes infectados con T. vivax se puede obtener un n�mero confiable de par�sitos en la sangre colectada despu�s de las 24 h, y m�s a�n, con mayor duraci�n si la muestra sangu�nea es conservada apropiadamente refrigerada.

Por otra parte la experiencia de campo de esta investigaci�n evidencia, que el material sangu�neo tomado de animales infectados naturalmente y/o experimentalmente con T. vivax debe ser procesado entre las 8 y 12 h de su extracci�n, ya que a partir de las 2 h de su toma, a pesar de que se mantenga en refrigeraci�n ocurre una p�rdida considerable de par�sitos en la sangre colectada.

Cuando las muestras sangu�neas tomadas a nivel de campo son conservadas en el medio de cultivo RPMI 1640, se observa que la sobrevivencia de los par�sitos es mayor si se mantiene el material en refrigeraci�n (hielo o nevera).

Igualmente, material crioprotegido de T. vivax y T. evansi (sangre infectada, RPMI, DMSO) descongelado y mantenido en una cava de anime con hielo seco pudo ser trasladado en un viaje de 48 b a la Guyana Francesa, . (EMVT -ClRAD-INSTITUT PASTEUR) sin que perdiera su viabilidad .

Posteriormente, la cepa de T. vivax fue replicada en una oveja, y la de T.evansi fue inoculada en ratones, recolectada y consecutivamente . replicada en una oveja. Ambas cepas, fueron criopreservadas en el Intitut Pasteur , en PBSG-Glicerol al 7%, para su respectivo uso en ensayos experimentales (DESOUESNES y TRESSE, 1996b) .

CONCLUSIONES

• Conocido los costos de los tanques de nitr�geno y del l�quido mismo, la modificaci�n del medio de conservaci�n de T. vivax  y T. evansi, permitir� emplear una fuente alternativa para recolecci�n y transporte de aislados de campos al laboratorio, mantenidos en hielo seco. 

• As� mismo, favorecer� que diferentes laboratorios nacionales de investigaci�n, trasladen los tripanosomas citados y/o otros hemopar�sitos, por ejemplo (Babesia sp, Anaplasma sp ), sin costos relevantes, permitiendo a la vez, otras actividades como la creaci�n de bancos de hemopar�sitos.

SUMMARY

The purpose of this communication is to inform the modifications in the freezing method of Trypanosoma vivax carried out by Espinoza and Tortolero, these were based on the replacement of PBS by the culture media RPMI 1640 (Sigma). The viability, infectivity and pathogenicity of  T. vivax, Trypanosoma evansi was satisfactory for the experimental studies. Futhermore this change could permit the transport of blood samples taken from the field to the laboratory, in a period of 48 hours, with a lower cost, after replacement of liquid nitrogen by dry ice.

Key Words: Trypanosma, RPMI 1640; conservation; dry ice.

BIBLIOGRAFIA 

ARIAS, J. 1993. Prevalencia del Trypanosoma evansi en chiguires (Hydrochoeris hydrochaeris) en sabanas innundables del Estado Apure. Tesis. M.Sc. Universidad de los Llanos Ezequiel Zamora. 139 p. 

DESQUESNES, M. and L. TRESSE. 1996a. Resistance to diminazene aceturate and isometamidium chloride in some South American T. vivax and T. envasi; consequences on treatment and chemoprophylasis. In: Proceedings on the First Symposium on New World Trypanosomes. Georgetown. Guyana. 10 p. 

DESQUESNES, M. and L. TRESSE. 1996b. Utilisation of T.evansi antigens in indirect Elisa for diagnosis of  Chagas disease in humans. In: Proceedings of First Symposium on New World Trypanosomes. Georgetowo. Guyana. 5 p.

EKWURUKE, J ., B. IKEDE and B. OPASINA. 1985. Survival period of fiel isolates of Trypanosoma vivax in refrigerated blood. Acta Tropica 42:273- 274.

ESPINOZA, E. y E. TORTOLERO. 1990. Un m�todo simple de conservaci�n de Trypanosoma vivax para su uso en infecciones experimentales. In: Hemopar�sitos: Biolog�a y Diagn�stico. Caracas. Universidad Sim�n Bol�var. pp 148-154.

 GARCIA, F. 1988. Infecci�n experimental de caballos con Trypanosoma evansi ( = T.venezuelense ). Aspectos patol�gicos y antig�nicos. Trabajo de ascenso. Universidad Central de Venezuela. 170 p. 1988. 

MAVARE, M., F. GARCIA y E. ESPINOZA. 1996. Efecto de la infecci�n experimental del Trypanosoma vivax sobre par�metros cl�nicos y hematol�gicos en cabras. In: III Congreso de Ciencias Veterinarias. Maracay. Venezuela. FCMVV-CMVEA. p 130. 

RIVERA, M. 1996. Hemoparasitosis bovina. Caracas. Universidad Central de Venezuela. 243 p. 

SANDOVAL, E., E. ESPINOZA y A. VALLE. 1996. Variaciones hematol�gicas en ovejas infectadas experimentalmente con Trypanosoma vivax. In: III Congreso de Ciencias Veterinarias. FCMVV-CMVEA. p 129.

YOKATY, S., V. McPHERSON, E. CAMUS and L. APPLEWHAITE. 1993. Ovine trypanosomosis a seroepidemiological survey in coasta Guyana. Revue D'Elevage de Medicine Yeterinary Des Pays Tropicaux 46(1-2):57-59.