Veterinaria Tropical. 22(2): 189-194. 1997

NOTA

SOBREVIVENCIA DEL Trypanosoma vivax (cepa I IV) y Trypanosoma evansi (cepa TEVAl) 
EN CONDICIONES EXPERIMENTALES

Emir Espinoza*, Nersa González**, Gisela Primera***, Marc Desquesnes**** y Luís Hidalgo**

*Investigador. Centro de Investigaciones Agropecuarias del estado Guárico. Carretera
Nacional vía Calabozo. Apure. Edo. Guárico.
**Profesores. Universidad Simón Rodríguez (Rectorado) Apdo. 3690 y Universidad
Simón Bolívar (Bioterio) Apdo. 89000, respectivamente. Caracas 1010. Venezuela.
***Profesora. Universidad Central de Venezuela. Post-Grado. Facultad de Ciencias
Veterinarias. Maracay 2103, estado Aragua. Venezuela.
****Institut Pasteur, Guyane Francaise. RECIBIDO: mayo 26, 1997.

RESUMEN

El propósito de esta comunicación es informar sobre las modificaciones en el método de congelación de Trypanosoma vivax realizado por Espinoza y Tortolero, estas se basaron en el reemplazo del  PBS por el medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma). La viabilidad, infectividad y patogenicidad de los T. vivax y Trypanosoma evansi fueron satisfactorias para los estudios experimentales. Además, podría permitir el traslado al laboratorio a un menor costo, en un período de 48 horas, de muestras sanguíneas tomadas en el campo, al sustituir el nitrógeno líquido por hielo seco.

Palabras Claves: Trypanosoma; RPMI 1640; conservación; hielo seco.

INTRODUCCIÓN

Desde finales de la década de 1980 se ha propagado en el país de mayor interés por el estudio de la tripanosomiasis animal, causada por Trypanosoma vivax y Trypanosoma evansi, situación que va a la par con las motivaciones sobre el tema por parte de otros investigadores en el continente americano tropical y sub tropical (VOKATI et al., 1993; RIVERA, 1996).

En Venezuela, la atención ya no sólo se centra en la ganadería bovina, sino también en las explotaciones equinas, ovinas, caprinas e inclusive las no domésticas (GARCIA, 1988; ARIAS, 1993; SANDOVAL et al., 1996; MAVARE et al., 1996). No obstante, la conservación y transporte a bajas temperaturas del T. vivax americano tiene la reputación de ser inestable. Las técnicas de mantenimiento que se usan para este hemoparásito, tal como su multiplicación en pequeños rumiantes y la criopreservación en nitrógeno líquido, actualmente, son muy costosas.

Por lo tanto, el objetivo de esta comunicación es informar sobre los períodos de sobrevivencia obtenido de manera experimental en aislados venezolanos de T. vivax (cepa IIV) y T. evansi (cepa TEVAI), basado en algunas modificaciones de conservación, preservación y transporte de Trypanosoma sp, realizadas anteriormente por ESPINOZA y TORTOLERO (1990) para su uso en investigaciones clínicas, diagnósticas, epidemiológicas, reproductivas y de resistencia a drogas, tanto en Venezuela como en la Guyana Francesa (DESQUESNES y TRESSE, 1996a).

MATERIALES Y MÉTODOS

El procedimiento de criopreservación se realizó manteniendo en su mayor parte el protocolo descrito por ESPINOZA yTORTOLERO (1990), modificando el paso I, al reemplazar la solución amortiguadora (PBS) por un medio de cultivo, en este caso RPMI 1640, sin añadirle bicarbonato de sodio, ni antibiótico, y la eliminación del paso 2. De tal manera, el protocolo quedó como se describe a continuación:

• Se prepara una solución del medio de cultivo, RPMI 1640 (1 frasco o papeleta, Sigma) en 11 de agua destilada.

• Se elabora una mezcla crioprotectiva basada en dimetil sulfóxido (DMSO ) al 10%, contenida en la solución preparada en el paso 1. (1volumen de DMSO en 9 volúmenes de RPMI).

• Se toma sangre infectada de un rumiante extraída de la vena yugular, o un donante roedor, vía intracardíaca, infectados experimentalmente, en el momento pico de la parasitemia

• El crioprotectivo DMSO al 10% se mezcla volumen a volumen con la sangre infectada, de modo que la dilución final quede al 5%.

• A continuación la mezcla (sangre infectada + DMSO) se coloca en viales crioprotectivos de 1 ml, protegido con papel de aluminio, y se sumergen en el fondo del tanque de nitrógeno líquido.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al día siguiente del proceso de congelación, una muestra del material estabilizado se descongeló mediante la colocación del vial en un recipiente con agua a temperatura ambiente, seguidamente se efectuó la valoración del mismo en un período de revisión a intervalos de 6, 12, 24, 36 y 48 h, manteniendo siempre el estabilizado en hielo. Indistintamente, del tripanosoma evaluado (T. vivax o T. evansi), la viabilidad de los mismos fue considerada subjetivamente satisfactoria, cuando a las 24 h no se observó reducción en la masa de parásitos de las muestras analizadas en el portaobjeto a través del microscopio de luz. Sin embargo, a las 36 h fue notado en el estabilizado de T. vivax una reducción en un 30% ya las 48 h una disminución en la masa parasitaria, estimada en menos del 50%.

El estabilizado de T. evansi, a las 36 y 48 de examinado presentó mayor porcentaje de sobrevivencia. Después del lapso del ensayo, el material congelado fue considerado no viable al no poderse detectar tripanosomas vivos o al ser muy escasa su presencia.

EKWURUKE et al. (1985) encontraron en sangre de ovejas y cabras infectadas con T. vivax, que antes de las 24 y 26 h, respectivamente, el número de parásitos permanecía constante, y por lo tanto infirieron que en pequeños rumiantes infectados con T. vivax se puede obtener un número confiable de parásitos en la sangre colectada después de las 24 h, y más aún, con mayor duración si la muestra sanguínea es conservada apropiadamente refrigerada.

Por otra parte la experiencia de campo de esta investigación evidencia, que el material sanguíneo tomado de animales infectados naturalmente y/o experimentalmente con T. vivax debe ser procesado entre las 8 y 12 h de su extracción, ya que a partir de las 2 h de su toma, a pesar de que se mantenga en refrigeración ocurre una pérdida considerable de parásitos en la sangre colectada.

Cuando las muestras sanguíneas tomadas a nivel de campo son conservadas en el medio de cultivo RPMI 1640, se observa que la sobrevivencia de los parásitos es mayor si se mantiene el material en refrigeración (hielo o nevera).

Igualmente, material crioprotegido de T. vivax y T. evansi (sangre infectada, RPMI, DMSO) descongelado y mantenido en una cava de anime con hielo seco pudo ser trasladado en un viaje de 48 b a la Guyana Francesa, . (EMVT -ClRAD-INSTITUT PASTEUR) sin que perdiera su viabilidad .

Posteriormente, la cepa de T. vivax fue replicada en una oveja, y la de T.evansi fue inoculada en ratones, recolectada y consecutivamente . replicada en una oveja. Ambas cepas, fueron criopreservadas en el Intitut Pasteur , en PBSG-Glicerol al 7%, para su respectivo uso en ensayos experimentales (DESOUESNES y TRESSE, 1996b) .

CONCLUSIONES

• Conocido los costos de los tanques de nitrógeno y del líquido mismo, la modificación del medio de conservación de T. vivax  y T. evansi, permitirá emplear una fuente alternativa para recolección y transporte de aislados de campos al laboratorio, mantenidos en hielo seco. 

• Así mismo, favorecerá que diferentes laboratorios nacionales de investigación, trasladen los tripanosomas citados y/o otros hemoparásitos, por ejemplo (Babesia sp, Anaplasma sp ), sin costos relevantes, permitiendo a la vez, otras actividades como la creación de bancos de hemoparásitos.

SUMMARY

The purpose of this communication is to inform the modifications in the freezing method of Trypanosoma vivax carried out by Espinoza and Tortolero, these were based on the replacement of PBS by the culture media RPMI 1640 (Sigma). The viability, infectivity and pathogenicity of  T. vivax, Trypanosoma evansi was satisfactory for the experimental studies. Futhermore this change could permit the transport of blood samples taken from the field to the laboratory, in a period of 48 hours, with a lower cost, after replacement of liquid nitrogen by dry ice.

Key Words: Trypanosma, RPMI 1640; conservation; dry ice.

BIBLIOGRAFIA 

ARIAS, J. 1993. Prevalencia del Trypanosoma evansi en chiguires (Hydrochoeris hydrochaeris) en sabanas innundables del Estado Apure. Tesis. M.Sc. Universidad de los Llanos Ezequiel Zamora. 139 p. 

DESQUESNES, M. and L. TRESSE. 1996a. Resistance to diminazene aceturate and isometamidium chloride in some South American T. vivax and T. envasi; consequences on treatment and chemoprophylasis. In: Proceedings on the First Symposium on New World Trypanosomes. Georgetown. Guyana. 10 p. 

DESQUESNES, M. and L. TRESSE. 1996b. Utilisation of T.evansi antigens in indirect Elisa for diagnosis of  Chagas disease in humans. In: Proceedings of First Symposium on New World Trypanosomes. Georgetowo. Guyana. 5 p.

EKWURUKE, J ., B. IKEDE and B. OPASINA. 1985. Survival period of fiel isolates of Trypanosoma vivax in refrigerated blood. Acta Tropica 42:273- 274.

ESPINOZA, E. y E. TORTOLERO. 1990. Un método simple de conservación de Trypanosoma vivax para su uso en infecciones experimentales. In: Hemoparásitos: Biología y Diagnóstico. Caracas. Universidad Simón Bolívar. pp 148-154.

 GARCIA, F. 1988. Infección experimental de caballos con Trypanosoma evansi ( = T.venezuelense ). Aspectos patológicos y antigénicos. Trabajo de ascenso. Universidad Central de Venezuela. 170 p. 1988. 

MAVARE, M., F. GARCIA y E. ESPINOZA. 1996. Efecto de la infección experimental del Trypanosoma vivax sobre parámetros clínicos y hematológicos en cabras. In: III Congreso de Ciencias Veterinarias. Maracay. Venezuela. FCMVV-CMVEA. p 130. 

RIVERA, M. 1996. Hemoparasitosis bovina. Caracas. Universidad Central de Venezuela. 243 p. 

SANDOVAL, E., E. ESPINOZA y A. VALLE. 1996. Variaciones hematológicas en ovejas infectadas experimentalmente con Trypanosoma vivax. In: III Congreso de Ciencias Veterinarias. FCMVV-CMVEA. p 129.

YOKATY, S., V. McPHERSON, E. CAMUS and L. APPLEWHAITE. 1993. Ovine trypanosomosis a seroepidemiological survey in coasta Guyana. Revue D'Elevage de Medicine Yeterinary Des Pays Tropicaux 46(1-2):57-59.