Veterinaria Tropical 24(1): 37-45. 1999

FLORA BACTERIANA AERÓBICA DEL SEMEN EQUINO

Yuraima Pineda*, Aura G. de López* y Fanny de Aponte**

  *Investigadores. FONAIAP.
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias.
Apdo. 70. Las Delicias. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.
  
 **Técnico Asociado a la Investigación. FONAIAP.
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias.
Apdo. 70. Las Delicias. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.

Recibido: diciembre 08, 1998.

  RESUMEN

 Se realizaron estudios bacteriológicos de 96 muestras de semen e hisopados uretrales de sementales equinos en uso regular, procedentes de 16 haras de 7 estados de Venezuela. Los resultados bacteriológicos indican la presencia de una amplia variedad de bacterias de la flora normal y patógenos. Los más frecuentes fueron Pseudomonas aeruginosa (20,83%), Staphylococcus epidermidls (18, 75%), Bacillus sp. (12,5%), Steptococcus sp., beta hemolítico (7,29%). Klebsiella pneumonlae fue aislada sólo en el 2,08% de las muestras. 

Palabras Clave: Flora bacteriana; semen; equino. 

INTRODUCCIÓN 

Con el incremento de la inseminación artificial en los últimos años, la fertilidad del semental equino ha sido una de las mayores inversiones en los establecimientos de cría equina. Por lo que exámenes satisfactorios con referencia al semen equino son obligatorios, antes de permitir la entrada de un semental a un programa de monta. Esta regla es con el fin de prevenir infecciones de transmisión sexual (Colenbrander et al., 199Z; Klug y Sieme, 1992). 

Aún cuando las investigaciones realizadas generalmente asocian infertilidad con infección bacteriana, en ocasiones no es fácil determinar el significado de los hallazgos bacteriológicos. Sin embargo, el examen bacteriológico del semen debe ser aceptado como un procedimiento de rutina, se toma en cuenta que los agentes etiológicos responsables de infecciones genitales en las yeguas son fundamentalmente bacterianos y que originan infecciones venéreas (Colenbrander et al., 1992; Hurtgen, 1992). 

Los agentes bacterianos responsables de infecciones venéreas en los equinos son Taylorella equigenilalis, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae; generalmente no causan infecciones aparentes en el semental, pero son capaces de invadir activamente los genitales de la hembra en contacto, causando brotes de endometritis aguda y baja fertilidad  (CoutoyHughes, 1993; Klugy Sieme, 1992;Mackintosh, 1981). Sin embargo, condiciones patológicas como vesiculitis seminal y epidedimitis causadas fundamentalmente por P. aeruginosa y K. pneumoniae han sido observadas en otros experimentos. Estas condiciones son fácilmente diagnósticadas por el crecimiento masivo en cultivo puro del agente causal  (Held et al., 1990). 

El papel patológico de K. pneumoniae estaba circunscrito a los serotipos 1, 2 y 5. Sin embargo, se ha demostrado que la presencia de otros serotipos como el 7 son causa potencial de metritis, aunque en menor proporción (Kikuchiet al., 1987), por lo que asumir patogenicidad basándose en el factor serotipo no es un método seguro ni confiable. En consecuencia cada serotipo capsular de K pneumoniae debe ser considerado como un patógeno de transmisión sexual (Rossdale y Ricketts, 1980). 

En lo que respecta a P. aernginosa, Hughes et al. (1967) consideraron que su aislamiento no necesariamente indica presencia de infección venérea, porque su estudio demostró una buena rata de concepción en la mayoría de los sementales analizados y sólo en algunos pobre fertilidad. Sin embargo, Kenney et al., citado por Malmgren et al. (1998), deja en evidencia diferencias en cuanto a patogenicidad en diferentes aislamientos de P. aernginosa por lo que igualmente su presencia debe ser considerada. 

Existen otras bacterias aisladas del semen y tracto genital de equino consideradas como patógenos potenciales o responsables de endometritis no venéreas o no específicas como son Streptococcus beta hemolítico, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus y Enterobacter (Klug y Sieme, 1992). Estos son considerados patógenos oportunistas y forman parte de los genitales externos de sementales saludables y algunos investigadores consideran su presencia en el semen como un proceso natural (Tischners y Kosiniak, 1982). Sin embargo, esta flora puede alcanzar el útero en la hembra durante la monta y después del parto y las infecciones que provocan pueden resolverse en el transcurso de 72 horas. Aunque esto depende de los mecanismos de defensa uterina así como de la virulencia y dosis de la bacteria invasora (Cheung et al., 1985). 

Este trabajo se realizó con la finalidad de evaluar la flora bacteriana aeróbica presente en el semen fresco y la uretra de sementales equinos en uso regular.

 MATERIALES Y MÉTODOS 

Se recolectaron 86 muestras de semen fresco y 10 hisopados uretrales de equinos asépticamentc y fueron remitidas al Laboratorio de Bacteriología del Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP) durante el período 1993-1998. Las muestras procedían de sementales equinos en uso regular de 16 haras ubicadas en 7 estados de Venezuela.

 Se tomaron 2-3 ml de semen fresco en viales estériles y para los hisopados se utilizó el culturette, o bien con hisopos convencionales colocados en medio de transporte Amies (Difco) y de inmediato fueron enviados al laboratorio. Todas las muestras fueron tomadas antes de cada estación de monta de animales aparentemente sanos. 

Examen bacteriológico 

El semen y los hisopados fueron sembrados directamente en cada uno de los siguientes medios de cultivos: agar sangre ovina al 5%, agar alcohol feniletílico, agar triptosa, agar MacConkey, agar Salmonella shigella. Estos medios fueron incubados en aerobiosis por 1 a 3 días a 37 °C. Las muestras que no revelaron crecimiento en el lapso de 3 d de incubación fueron consideradas negativas. 

La metodología para el aislamiento e identificación bacteriana siguió los procedimientos convencionales de diagnóstico bacteriológico (Koneman et al., 1979; Ewards y Ewing, 1972).

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados del estudio bacteriológico obtenido de las 86 muestras de semen fresco y 10 hisopados uretrales equinos aparecen reflejados en el Cuadro 1.

Una amplia variedad de géneros bacterianos entre flora normal y patógena fueron aislados. El mayor porcentaje de aislamiento correspondió a P. aeruginosa con 20,83%, aunque estos aislamientos no fueron tipificados, el mayor número de muestras fue de semen fresco. Por el contrario K.  pneumoniae sólo fue aislada en el 2,08% de la totalidad de las muestras, fundamentalmente de hisopados uretrales. Ambos agentes son considerados como causales de infecciones de transmisión sexual.

De igual manera, Streptococcus beta hemolítico, se aisló en el 7 ,29% seguido de otros patógenos potenciales como E. coli 5,20%, S. aureus 4,16% y S. zooepidemicus 2,08%. 

Los casos de aislamiento bacteriano en cultivo puro predominaron sobre los aislamientos en cultivo mixto, en los cuales las asociaciones fueron de dos y tres géneros bacterianos en semen fresco. Los cultivos de muestras de hisopados uretrales no exhibieron crecimiento mixto. En el resto de los cultivos no se detectó desarrollo bacteriano (Cuadro 2).

  En este estudio se señala la presencia de P. aeruginosa como un aislamiento frecuente de las muestras de semen equino, diagnosticándose en un 20,8%, estos resultados son semejantes a los obtenidos por Hughes et al. (1967) quienes la encontraron con una alta frecuencia en el semen. Igualmente Oanek et al. (1994) la señalan con frecuencia de 10% en el total de las muestras estudiadas, y más recientemente, Malmgren et al. (1998) informan sobre frecuencias de 40% de aislamiento de P. aeruginosa.

 Aunque existen investigaciones donde P. aeruginosa no es la bacteria de más frecuente aislamiento (Madsen y Christenden, 1995; Klug y Sieme, 1992) se debe tener en cuenta al comparar estudios, que los mismos pueden diferir en términos de técnicas de muestreo, zonas de muestreo, método de transporte y frecuencia. En este sentido Hughes et al. (1967) revelan que la posibilidad de obtener más cultivos positivos de P. aeruginosa aumenta si se realiza más de un cultivo al mismo animal. 

Estas marcadas diferencias en la frecuencia de aislamiento de P. aeruginosa entre diversos estudios puede ser debido a contaminación con una fuente ambiental. Kenney et al., citado por Malmgren et al. (1998) sugieren que la contaminación con P. aeruginosa puede provenir del medio ambiente próximo al animal como aguas estancadas, vagina artificial y con esto contribuir al estado de portador . 

En este trabajo el aislamiento de P. aeruginosa de hisopados uretrales fue muy bajo en relación con los obtenidos de muestras de semen, de un total de 10 muestras sólo se logró su aislamiento en una, lo cual coincide con los resultados de Malmgren et al. (1998). Esto indica que la bacteria coloniza inicialmente la superficie del pene y prepucio, y posteriormente el semen se contamina de forma secundaria durante la eyaculación. 

Aunque en la literatura existen muchas controversias en cuanto al significado de ciertos seroptipos de P. aeruginosa relacionadas con la fertilidad, se concluye que todos los serotipos en mayor o menor grado tienen potencial patógeno, al señalarse falta de correlación entre patogenicidad y grupo serológico en brotes de endometritis en yeguas (Atherton y Pitt, 1992). Esta condición debe alertar al clínico quién debe preveer el riesgo de infección y tratar adecuadamente la situación.

 La bacteria K. pneumoniae fue aislada sólo en 2,08% de hisopados uretrales. Aunque en este caso no se determinaron los antígenos capsulares la presencia de esta especie a cualquier nivel del tracto genital, debe ser considerada, ya que se conoce que independientemente del serotipo, es capaz de causar brotes de endometritis aguda y baja fertilidad en yeguas (Couto y Hughes, 1993; Kikuchi et al., 1987; Rossdale y Ricketts, 1980; Klug y Sieme, 1992).

 La presencia de estos dos géneros bacterianos en el tracto genital del macho debe ser tomada con reserva, en vista de que existen trabajos en el país que los señalan como responsables de endometritis venéreas (Gallardo et al., 1982). 

Aunque se ha demostrado que agentes bacterianos oportunistas no afectan la calidad del semen (Danek et al., 1993), sí se ha adjudicado su responsabilidad en la aparición de endometritis no venéreas o no específicas (Gallardo et al., 1982). En el trabajo el mayor aislamiento de estos agentes correspondió a Streptococcus beta hemolítico con 7,29%. Varios autores han aislado Streptococcus beta hemolítico del semen equino (Danek et al., 1993; Klug y Sieme, 1992; Madsen y Christensen, 1995) y la prevalencia de caballos infectados por este agente se incrementa durante la estación de monta (Klug y Sieme, 1992).

Escherichia coli fue aislado en un 5,20% de manera similar a los hallazgos de Oanek et al. (1993). En el pasado este agente fue considerado como primera causa de infección en yeguas en Gran Bretaña. La presencia de otros agentes etiológicos oportunistas como S. aureus, Proleus y Enlerobacler también se presentan en este trabajo en porcentajes significativos similar a lo indicado por Malmgren et al. (1998).

 Contaminantes no patógenos fueron aislados como S. epidennidis y Bacillus sp., considerados comúnmente presentes en el tracto genital equino (Blanchard et al., 1992) y similar a lo observado por Madsen y Christensen (1995) para S. epidennidis y Malmgren et al. (1998) para Bacillus sp. 

El resto de los agentes aislados, A. Iwoffi, A. pyogenes, Aeromonas sp., A. faecalis y S. intennedius son considerados igualmente contaminantes. 

Con el estudio se informa de los agentes bacterianos patógenos y oportunistas presentes en el semen equino. La interpretación de los resultados obtenidos y el papel que algunos agentes bacterianos desempeñan en la infertilidad requiere de futuras investigaciones. El estudio bacteriológico del tracto genital en equinos constituye un arma en la prevención y control de infecciones de transmisión sexual y en consecuencia en lograr una mejor eficiencia reproductora. 

SUMMARY 

An Aerobic bacterial flora study was perfomed on 96 semen samples and urethra swabs from normal stallions in regular use in 16 farms of 7 Venezuelan States. The results showed a wide variety of bacteria from normal and pathogenic flora. The most common organisms found were Pseudomonas aeruginosa (20,83%), Staphylococcus epidemidis (18,75%), Bacillus sp. (12,5%) Streptococcus sp., beta hemolítico (7,29%) Klebsiella pneumoviae was only isolated in 2,08% of the samples. 

Key Words: Bacterial flora; semen; stallion. 

BIBLIOGRAFÍA

A THER TON, J. G. and T. L. PITT .1982. Types of Pseudomonas aeruginosa isolated from horses. Equine Vet. J. 14:329-332.

BLANCHARD, T. L., R. M. KENNEY and P. J. TIMONEY. 1992. Venereal disease. Veterinary clinics of North America Equine Practiceo 8:191-203. 

CHEUNG, T. W., I. K. M. LIU, E. M. WALSH and M. E. MILLER. 1985. Phagocytic and killing capacities of uterine derived polymorphonuclear leukocytes fron mares resistant and susceptible to chronic endometritis. Am. J. Vet. Res. 46:1938-1940. 

COLENBRADER, B., H. PUYK, A. R. ZANDEE and J. PARLEVLIER. 1992. Evaluation of tbe stallion for breeding. Acta Vet. Scand suppl. 88:29-37. 

COUTO, M. A. and J. P. HUGHES. 1993. Equine reproduction. Ed. A. O. McKinnon and J. L. Voss Philadelphia. p. 845-854.

DANEK, J. E. WISNIEWSKI and J. KLIMCZAK. 1993. Facultative pathogens in the semen of horses. Bulletin of Veterinary Institute in Pulauy 37(2):94.,99.                                                            

DANEK, J. E. WISNIEWSKI, W. KRUMRYCH and W. DABROWSKA. 1994. Prevalence and sensitivity to antibiotics of facultative pathogenic bacteria isolated from semen of stallions Medycyna Veterynaryjna 50(8):385-387. 

EWARDS, P. R. and W. H. EWING. 1972. Identification of  Enterobacteriaceae Minnesota. 3rd. Edition. Burgers Publishing Company.

 GALLARDO de LOPEZ, A., J. POLANCO, Y. PINEDA de MORA y F. APONTE. 1982. Florabacteriana aeróbica del utero de yeguas infertiles. Veterinaria Trop. 7:3-17.

HELD, J. P., S. ADAIR, M. D. McGA VIN, W. H. ADAMS, R. TOAL and J. HENTON.l990. Bacterial epididymitis in 2 stallions. J. Amer. Vet. Med. Ass. 197:602-604. 

HUGHES, J. P., A. C. ASBURY, R. G. LOY and H. E. BURD.1967. The occurrence of Pseudomonas in the tract of stallions and its effects on fertility. Cornell Vet. 57:53-69. 

HURTGEN, J. P. 1992. Evaluation of the stallions for breeding soundness. Vet. Clin North Amer. equine. Pract. 8:149-165. 

KIKUCHI, J., I. INGUCHI and T. HIRAMUNE. 1987. Capsule types of Klebsiella pneumoniae isolated from the genital tract of stallions. Vet. Microbiol. 15:219-228.

KLUG, E. and H. SIEME. 1992. Infections agents in equine semen. Acta Vet. Scand. Supll. 88:73-81.

KONEMAN, E., S. ALLEN, V. R. DOWELL and H. SOMMERS. 1979. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Ed. J. B. Lippincott Company.

MADSEN, M. and CHRISTENSEN.1995. Bacterial flora of semen colleted from danish warmblood stallions by artificial vagina. Acta. Vet. Scand. 36:1-7. 

MACKINTOSH, M. E. 1981. Bacteriological techniques in the diagnosis of equine genital infections. Vet. Rec. 18:52-55.

MALMGREN, L., E. OLSSOL ENGV ALL, A. ENGV ALL and A. ALBIHM. 1998. Aerobic bacterial flora of semen and stallion reproductive tract and its relation to fertility under field conditions Acta Vet. Scand 39:173-182. 

ROSSOALE, P. O. and S. W. RICKETTS. 1980. Equine stud farms Medicine. London. 2nd ed. Bailliere Tindall p. 78-81.

TISCHNERS, M. and K. KOSINIAK. 1982. Techniques for collection and storage of stallion semen with minimal secondary contamination. Acta Vet. Scond Supll. 88:83-90.