Veterinaria Trop. 25(2):237-255.2000

VIRUS DE ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA EN EL MUNICIPIO CATATUMBO DEL ESTADO ZULIA. 1996-1997.II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN

Gladys Medina Gutiérrez *, Rosalba Salas **, Julieta de Siger *,
Edgar Jaimes ** e  Irineo Matheus

*Investigadores. INIA
Centro Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (CENIAP)
Instituto de Investigaciones Veterinarias (IIA)
Laboratorio de Arbovirus. Apdo.70
Maracay 2010, estado Aragua. Venezuela
**Profesoras
Instituto Nacional de Higiene y Facultad de Medicina
Instituto de Medicina Tropical, respectivamente
Ciudad Universitaria Caracas-Venezuela

Recibido: enero 11,2000

 RESUMEN

Para aislar el virus enzoótico/endémico de la Encefalitis Equina Venezolana (EEV) y establecer una correlación entre las cepas epizoóticas/epidémicas actuantes, durante 1992-1995, y las cepas enzoóticas/endémicas aisladas de los nichos ecológicos, se realizó una investigación en la parroquia Jesús María Semprúm (JMS) del municipio Catatumbo del estado Zulia. La metodología se basó en la exposición de hámsters centinelas, aislamiento e identificación de virus en los animales enfermos, colección, clasificación y aislamiento viral a partir de mosquitos, capturas y sangrías de pequeños roedores. Las técnicas usadas para la identificación de las cepas virales aisladas fueron: fijación de complemento e inmunofluorescencia indirecta, así como la técnica de reacción en cadena de la polimerasa-transcriptaza reversa (PCR-RT), secuenciación y análisis filogenético. Los resultados en esta investigación proporcionaron tres aislamientos del virus de EEV identificados como ID en la localidad de Río Claro y  las Nubes de la parroquia JMS, durante el mes de febrero de 1997, demostrándose que la transmisión enzoótica/endémica del virus de la EEV, variedad ID, aún está activa en el Catatumbo a pesar de los significantes cambios ecológicos ocasionados a los hábitats de bosque húmedo tropical. Las cepas virales aisladas indican que no existe relación entre las cepas de virus epidémicas actuantes durante 1995 y las cepas endémicas aisladas en febrero de 1997 en Catatumbo; sin embargo, existe correlación entre las cepas de virus de la EEV aisladas durante el brote de 1992 y las aisladas en 1997 en la misma región por lo que se requieren más aislamientos de virus endémicos para establecer una correlación entre las cepas endémicas y epidémicas de la EEV, y reconocer los posibles ancestros comunes de las cepas epidémicas.

Palabras Clave: EEV; endémico/enzoótico; epidémico/epizoótico; técnicas de identificación del virus; árbol filogenético.

INTRODUCCIÓN

La Encefalitis Equina Venezolana (EEV) es una enfermedad viral, transmitida por mosquitos infectados que afecta a los équidos y a los humanos (Fenner et al, 1987; Strauss and Strauss, 1988). Esta enfermedad deja secuelas neurológicas así como ocasiona daños fatales en los humanos; de hecho, durante la epizoodemia ocurrida en Venezuela en 1962, entre los meses de octubre y diciembre, se presentaron 6.762 casos en humanos con 43 defunciones (Avilán- Rovira, 1972, 1996). Así mismo, la epizootia iniciada en Ecuador durante 1968 se distribuyó hacia las regiones norte, centro y costa del continente americano hasta llegar a Texas (USA), muriendo entre 30 000 y 50 000 equinos, lo que afectó a la economía rural, ya que muchos campesinos utilizaban estos animales para las tareas agrícolas y transporte de productos (Acha y Szyfres, 1992).

Por otra parte, es bien conocida entre los arbovirologos la interrogante sobre el origen y mantenimiento de las cepas virulentas de la EEV en los períodos interepizoóticos que producen epidemias en formas esporádicas, surgiendo varias hipótesis del mecanismo de re-emergencia de estas cepas de la EEV, entre ellas: una transmisión poco intensa del virus de un equino a otro; el virus se propagaría con lentitud hasta tanto haya una gran población equina susceptible y se den las condiciones para una epizootia (Sudia, 1972).

Otra posibilidad es que existen concentraciones bajas de virus epizoótico en poblaciones de cepas enzoóticas que pueden iniciar un ciclo epizoótico visible mediante una combinación de selección aleatoria y pases fortuitos a través de mamíferos sensibles, incluidos équidos y humanos, que producen concentraciones de viremias elevadas, capaces de infectar vectores pocos eficaces (Dickerman et al., 1987).

También es posible una re-emergencia de virus epizoótico seguido de la administración de preparaciones de vacunas inadecuadamente inactivadas. (Kinney et al., 1992), o el mantenimiento del virus epizoótico en ciclos de transmisión silente similar al de los virus enzoóticos (Stanick et al, 1989).

Una última hipótesis postula que las cepas vírales epizoóticas/epidémicas derivan o tienen un ancestro común enzoótico similar a la variante ID (Walton y Grayson, 1988; Rico- Hesse et al., 1988). Esta última se basa en la mutación y selección de cepas vírales enzoóticas, que pueden amplificar el ciclo selvático local, cuando las condiciones son favorables, tales como estación lluviosa, con inundaciones y suficiente población de vertebrados susceptibles, así como vectores.

Esta predicción se ha venido verificando a través de análisis filogenéticos, mediante secuencias genéticas de las cepas enzoóticas y epizoóticas, así como  por el mapeo de oligonucleótidos del RNA genómicos de los virus de la EEV, sugiriendo que los virus epizoóticos IAB e IC pudieran resultar de mutaciones de cepas vírales enzoóticas, subtipo ID y/o IE. Estos hallazgos apuntan la existencia de un progenitor común para los virus IAB e IC (Trent et al.,  1979; Kinney et al., 1992, 1993; Rico-Hesse et al., 1988; Strauss and Strauss 1988: Weaver et al., 1992; Sneider et al., 1993). Esta hipótesis está  apoyada por la cercana relación antigénica y genética existente entre las variedades epidémicas IAB/IC y la variedad ID de los virus de la EEV Johnson and Martin, 1974; Walton and Grayson, 1988; Rico-Hesse et al., 1988; Weaver et al., 1992).

Análisis filogenéticos de los virus de la EEV, a partir de cepas representativas de  todas las variedades aisladas hasta la fecha, han sido generadas a partir de secuenciaciones parciales del genoma, proporcionado la primera evidencia concluyente del origen de las cepas epizoóticas/epidémicas del virus  de la EEV (Rico-Hesse et al., 1988).

El objetivo de esta investigación fue aislar virus enzoótico/endémico de  la EEV en áreas que favorecieran la circulación de los mismos, la caracterización de las cepas por métodos serológicos convencionales y por biología molecular, así como relacionar las cepas aisladas con las cepas de virus de la EEV que circularon durante 1992 y 1995.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio:  La parroquia José María Semprúm, municipio Catatumbo en el estado Zulia, Venezuela, fue seleccionada por ofrecer ambientes ecológicos favorables para la circulación y mantenimiento de las capas enzoóticas/endémicas de EEV, y de acuerdo a los resultados serológicos preliminares obtenidos durante 1995-1996.

Colocación de hámsters centinelas:  Mil siete hámsters dorados, Mesocricetus auratus, procedentes de las colonias del Instituto de Medicina  Tropical de la Universidad Central de Venezuela y del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", fueron colocados en jaulas suspendidas (0,5 y  l,0 m de altura) y expuestos a las picaduras de los mosquitos en ambientes de bosque húmedo tropical, zonas anegadizas y sombreadas del municipio seleccionado. A los animales se les colocó agua, alimento y fueron chequeados dos veces al día durante 10 días.

Cuando los hámsters comenzaban a enfermar y/o morir, eran retirados de las jaulas para la extracción de sangre y/o vísceras. Todas las muestras, previa identificación del animal y de la localidad, eran colocadas en crioviales para su almacenamiento en nitrógeno líquido o en hielo seco a -70 °C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Los animales sobrevivientes, luego de un período de observación, eran sangrados y posteriormente las muestras eran sometidas a estudios serológicos para la detección de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación (IHA) y anticuerpos seroneutralizantes en cultivos celulares (SN).

Capturas de mamíferos. En las mismas localidades en que eran ubicados los hámsters, se colocaron 55 trampas Tomahawk durante tres noches/localidad. Se utilizó como señuelo conchas de piña, plátano maduro y naranja, para atraer a los pequeños mamíferos presentes en los hábitats de bosque húmedo tropical.

Capturas de mosquitos. Fueron colocados 6 trampas CDC en diferentes puntos del área en estudio, para la captura de mosquitos. Se consideraron exclusivamente los mosquitos hembras para la clasificación entomológica y para realizar estudios virológicos.

 Procesamiento de las muestras: Órganos (hígado, corazón, bazo) procedentes de roedores silvestres capturados, así como de los hámsters enfermos o recién fallecidos y de los pool de mosquitos, fueron procesados en Buffer Phosfato pH 7,2 más bovoalbumina al     7,5%, para una concentración final al 10%. Las suspensiones a110% de órganos y mosquitos, así como los sueros procedentes de hámsters enfermos y roedores silvestres fueron inoculados con células VERO _E6  y/o ratones lactantes de tres días de nacidos, por vía intracerebral, para evidenciar efectos citopáticos o enfermedad, respectivamente.

Pruebas de laboratorio. La identificación preliminar se realizó a través de la técnica de fijación de complemento (FC), adaptada a la microtécnica de Saber (1962) y mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) descrita por Gardner y Maquillan (1974). Se utilizaron líquidos ascíticos hiperinmunes para los grupos A, B, C y Buyamwera suministrados y producidos por el laboratorio de Arbovirus del Instituto de Investigaciones Veterinarias; de referencia, anticuerpos monoclonales para los virus de la EEV, EEE y EEO, suministrados por Yale Arbovirus Reseach Unit y monoclonales para el complejo del virus de la EEV, suministrados por el Centro para el Control de las Enfermedades (CDC) de Fort Collins Co. (5B4C-6; IAIB-9; IA3B-9) y monoclonales para el complejo de EEE (6B6B-I) y para EEO (2A6C- 7). La subtipificación fue realizado mediante el uso de anticuerpos monoclonales para el virus de la EEV y la amplificación de los virus aislados se realizó mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa Reversa (PCR-RT).

Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa Reversa. Los virus aislados fueron analizados genéticamente por PCR-RT amplificando unos 851 pares de bases del genoma que incluye parte del gen E₃ y la mitad 5'terminal del gen de la glicoproteína de envoltura E₂ (posiciones 8390- 9006¹⁰). El producto del PCR-RT fue secuenciado usando un Secuenciador automatizado Applied Biosystems y el análisis filogenético mediante el PAUP parsimony algoritmo (Swofford y Paup, 1991) y los programas filogenéticos PHYLIP (Felsenstein, 1985, 1990).

RESULTADOS Y  DISCUSIÓN

Exposición de hámsters centinelas y estudios filogenéticos: En el Cuadro 1 se muestra la distribución de hámsters expuestos en la parroquia Jesús María Semprúm, municipio Catatumbo, observándose que de un total de 1.007 (10.070 hámsters-noche), se aislaron tres cepas del virus de la EEV, ubicados en las fincas Las Nubes y Río Claro de esa parroquia. Los hámsters enfermaron tres días después de la exposición, mostrando síntomas compatibles con la encefalitis por arbovirus: se observaban quietos o con pocos movimientos, ojos lagrimosos, pelos erizados, hipersensibilidad al tacto y fotofobia.

Suspensiones de órganos y sueros procedentes de los animales enfermos fueron inoculados en los sistemas susceptibles: células Vero y ratones lactantes, evidenciándose efecto citopático o enfermedad, respectivamente en un período de 36-48 horas. La tipificación fue realizada mediante las técnicas de FC y por IFI, reaccionando con los líquidos ascíticos hiperinmunes y de referencia para el grupo "A" (Togavirus) de los arbovirus.

Posteriormente, estas muestras fueron analizadas mediante el uso de anticuerpos monoclonales para los virus de las EEV, EEE y EEO, identificándose como pertenecientes al complejo del virus de la EEV; luego, por IFI y mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos a las cepas enzoóticas y epizoóticas de EEV, se determinó que el aislado pertenecía a una cepa enzoótica /endémica variedad ID.

Se aislaron otros arbovirus a partir de los hámsters centinelas, tal como: virus UNA, Pixuna, Mayaro, Ilheus, virus perteneciente al grupo C aun no clasificado y virus Guama (Cuadro 1). Los estudios filogenéticos revelaron que los aislados de la EEV, durante 1997, en la parroquia JMS, corresponden a cepas endémicas ID identificadas como IDZPC231 y IDZPC260 y las mismas formaron grupos monofiléticos con otras cepas de la EEV identificadas también como ID (Figura 1).

Captura de mosquitos. No hubo aislamiento viral para ningún arbovirus a partir de las suspensiones preparadas. Sin embargo, la dinámica poblacional tuvo una mayor proporción para el genero Culex melanoconium spp. representando un 40% del total de mosquitos capturados, mientras que el índice de dominancia observado fue 70%, compartido entre el Culex melanoconium spp. y el Culex culex spp., ambos géneros, involucrados en los ciclos de transmisión enzoótica/endémica del virus de la EEV. Otros mosquitos, capturados en menor proporción, fueron de los géneros Mansonia, Psorosphora y Aedes (Cuadro 2).

Captura de roedores silvestres. El Cuadro 3 muestra la distribución de roedores silvestres capturados en la parroquia JMS, municipio Catatumbo. No hubo aislamiento viral para ninguno de los arbovirus y tampoco se evidenciaron anticuerpos IHA o SN en las muestras analizadas para la EEV. Estos resultados evidenciaron la baja densidad poblacional de pequeños mamíferos en estas áreas, los cuales son las fuente principal para la multiplicación y mantenimiento de las cepas enzoóticas en hábitats de bosque húmedo tropical. Durante el estudio, también se observó la deforestación de amplias zonas boscosas, lo cual implica rotura del equilibrio ecológico y migración de animales hacia otras zonas que permitan su mantenimiento y reproducción en la naturaleza.

Estudios Fitogenéticos. Tres cepas de virus de la EEV, subtipificadas como ID, fueron aisladas en febrero de 1997. En el árbol (Figura 2), estas cepas están identificadas como ZPC231 y IDZPC260. Al tomar el producto del PCR -RT para secuenciar y posteriormente construir el árbol filogenético con las cepas de virus, se evidencia que las cepas aisladas formaron grupos monofiléticos con las cepas ID VE76, VE81 y guardaban una estrecha relación con las cepas ID CO83. (Resultados proporcionados por la Universidad  de Texas Medical Branch en Galveston, Departamento de Patología, coordinado por el Dr. Scott Weaver).

FIGURA 2. Árbol filogenético de las cepas de virus de la EVV aisladas durante el brote de 1992 (tomado de Rico-Hesse et al., 1995).

Las cepas de virus de la EEV aisladas durante el brote epidémico en Venezuela durante 1992-1993 formaron grupos monofiléticos y están estrechamente relacionadas con la cepa ID aisladas en 1981 y 1983, considerándose que los virus endémicos de la EEV que circulan al noroeste de Colombia y noreste de Venezuela generan, vía mutación, cepas epidémicas IC (Figura 3).

FIGURA 3. Árbol fitogenético de las cepas de virus de la EVV aisladas durante la epidemia del 1995 (tomado de Weaver et al., 1996).

Los virus de la EEV que circularon en Venezuela durante 1995 formaron grupo monofilético con los aislados de EEV de 1962-1964 y estaban más estrechamente relacionados al aislamiento viral de mosquitos en Panaquire, estado Miranda. No hubo correlación entre los aislados epidémicos de 1992 y 1995 (Figura 3).

Los tres aislamientos del virus de la EEV correspondientes a cepas endémicas/enzoóticas, variedad ID, en la parroquia JMS, municipio Catatumbo, sugieren que los ciclos silvestres para la EEV se mantienen en forma continúa y con intensidad variable, dependiendo de ciertas condiciones ambientales, ecológicas y climatológicas.

Cepas vírales de la EEV aisladas en ambientes de bosque húmedo tropical, han sido halladas por Walder and Suárez (1976), en la región de Catatumbo, por Querales et al. (1985) en Panaquire, estado Miranda y por Dickerman et al. (1987), al norte de Colombia. El reconocimiento de circulación de otras cepas de virus pertenecientes a Mayaro, Ilheus, UNA, Virus Grupo "C" y Guama en las mismas áreas o cercanas donde circulan las cepas endémicas de la EEV permite inferir que estos virus comparten sus nichos ecológicos y, en consecuencia, existe una fuerte competencia entre ellos y sus vectores para la persistencia y mantenimiento de los mismos en pequeños focos.

 Walter et al., 1984; Dickerman et al., 1987; Rico-Hesse et al., 1988 señalan que la persistencia de focos enzoóticos de la EEV y los mismos se encuentran a pequeñas distancias uno de los otros en ambientes de bosque húmedo tropical. En consecuencia, el aislamiento de cepas virales de la EEV dependerá de la expansión o retracción de los nichos ecológicos, de la población de vectores, de la densidad poblacional de pequeños mamíferos y de los cambios ecológicos que se presentan en dichas áreas.

No hubo aislamiento viral a partir de mosquitos ni reservorios silvestres para el virus de la EEV, así como tampoco se detectaron anticuerpos mediante la técnica de IHA. Los resultados obtenidos a partir de los estudios entomológicos demostraron, que el índice de dominancia estuvo compartido entre los géneros de los mosquitos C. melanoconium spp. y  C. culex spp. Investigaciones hechas por Walter and Suárez, 1976 y 1984; Scherer et al., 1971, 1975 y 1976; Sudia et al., 1972, 1975; Walton and Grayson 1988 y Cupp et al., 1979 señalan que ambos vectores están involucrados en los mecanismos de transmisión endémicos del virus de la EEV.

 Los estudios filogenéticos de las cepas aisladas, a partir de hámsters centinelas apoyan la teoría de que los virus epizoóticos/epidémicos derivan de un ancestro común endémico y se requieren condiciones locales que permitan mutaciones aleatorias en las secuencias de aminoácidos. Esta teoría hasta la fecha ha sido demostrada para ciertos linajes de cepas endémicas ID y IE. Secuenciaciones parciales del genoma de diferentes  cepas representativas , del virus dc la EEV realizadas por Weaver et al., 1990, 1992, y 1996; Rico -Hesse et al., 1988 y 1995 han revelado  que  las cepas aisladas durante  el  brote epidémico  en Venezuela durante 1992-1993 formaban grupos monofiléticos y están  estrechamente relacionado con la cepa ID aislada en 1981, 1983 (Figura 1) y los aislados de 1997 identificados en el árbol  genealógico como  ID ZPC260 y ZPC231 (Figura3) en Venezuela y Colombia  respectivamente; mientras que el  virus dc la EEV que circuló en Venezuela durante 1995, formó grupo  monofiléticos con los aislados dc la EEV dc 1962-1964 y estaba  más estrechamente  relacionado al l aislamiento viral de mosquitos en Panaquire  estado Miranda (Figura 2). La posición ancestral de los virus enzoóticos  en el árbo1 genealógico apoyan y concluyen, que los virus epidémicos de la EEV emergen de hábitats dc transmisión dc cepas enzoóticas. Sin embargo, se requieren más aislamientos  vírales a partir de  hábitats enzoóticos, de diferentes regiones del país y secuencias adicionales de estas variedades para identificar con mayor precisión  los progenitores, de los virus variedad  IC de la EEV.

 AGRADECIMIENTO

Los autores  desean manifestar su agradecimiento por su valiosa colaboración en la ejecución de este trabajo, a: Luis Enrique Pérez, Luis Antonio Rodríguez, Josefina Blanco y Zenovia Vargas de Martínez; y a, Fundacite  Aragua, Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Endemias Rurales de Maracay y XV Región de Malariología del estado Zulia

SUMMARY

In order to isolations enzoótic/endémic virus of the venezuelan equine encephalitis (VEE) and to establish a correlation between epizootics/epidemics viruses acting during 1992-1995 and the enzootics/endemics straing isolated from ecological niches, an investigation was made in the parish Jesus Maria Semprúm (JMS), Catatumbo municipality of zulia State. Methodology was based on the exposition of sentinels hamsters, isolation and identification of viruses in sick animals, collection, classification and indentification of viruses in sick animals, collections, classification and viral isolations from mosquitoes, and capture and bleeding of smalls rodents. techniques used for the identification of isolated viral straing were: complement fixation and indirect inmunofluorescence, as wll as were as reverse Polymerasa-Transcriptasa chain reaction technique (PCR-RT), and sequencing and phylogenetic analysis. the results of this investigation provided three isolations of VEE viruses indentified as ID in the locality of Rio Claro and Las Nubes of JMS parish during the month of February 1997; indicating that the enzoótic /endémic transmission of the EEV viruses variety ID still active in Catatumbo in spite of the significant ecologial changes produced in the tropical forests. Viral strains isolated in February 1997 in Catatumbo; however a correlation exists between the strains of VEE viruses isolated during the 1992 outbreak and the ones isolated in 1997  in the same region, which suggests that more endemic VEE virus isolations are required in order to stablish correlation between the endemic and epidemics strains of VEE and to recognize the possible common ancestros of the epidemics strains.

 Key  Words: VEE; endemic/enzootic; epidemic/epizootic; PCR; philogenetic tree.

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