Veterinaria Trop. 25(2):237-255.2000

VIRUS DE ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA EN EL MUNICIPIO CATATUMBO DEL ESTADO ZULIA. 1996-1997.II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACI�N

Gladys Medina Guti�rrez *, Rosalba Salas **, Julieta de Siger *,
Edgar Jaimes ** e  Irineo Matheus

*Investigadores. INIA
Centro Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (CENIAP)
Instituto de Investigaciones Veterinarias (IIA)
Laboratorio de Arbovirus. Apdo.70
Maracay 2010, estado Aragua. Venezuela
**Profesoras
Instituto Nacional de Higiene y Facultad de Medicina
Instituto de Medicina Tropical, respectivamente
Ciudad Universitaria Caracas-Venezuela

Recibido: enero 11,2000


 RESUMEN

Para aislar el virus enzo�tico/end�mico de la Encefalitis Equina Venezolana (EEV) y establecer una correlaci�n entre las cepas epizo�ticas/epid�micas actuantes, durante 1992-1995, y las cepas enzo�ticas/end�micas aisladas de los nichos ecol�gicos, se realiz� una investigaci�n en la parroquia Jes�s Mar�a Sempr�m (JMS) del municipio Catatumbo del estado Zulia. La metodolog�a se bas� en la exposici�n de h�msters centinelas, aislamiento e identificaci�n de virus en los animales enfermos, colecci�n, clasificaci�n y aislamiento viral a partir de mosquitos, capturas y sangr�as de peque�os roedores. Las t�cnicas usadas para la identificaci�n de las cepas virales aisladas fueron: fijaci�n de complemento e inmunofluorescencia indirecta, as� como la t�cnica de reacci�n en cadena de la polimerasa-transcriptaza reversa (PCR-RT), secuenciaci�n y an�lisis filogen�tico. Los resultados en esta investigaci�n proporcionaron tres aislamientos del virus de EEV identificados como ID en la localidad de R�o Claro y  las Nubes de la parroquia JMS, durante el mes de febrero de 1997, demostr�ndose que la transmisi�n enzo�tica/end�mica del virus de la EEV, variedad ID, a�n est� activa en el Catatumbo a pesar de los significantes cambios ecol�gicos ocasionados a los h�bitats de bosque h�medo tropical. Las cepas virales aisladas indican que no existe relaci�n entre las cepas de virus epid�micas actuantes durante 1995 y las cepas end�micas aisladas en febrero de 1997 en Catatumbo; sin embargo, existe correlaci�n entre las cepas de virus de la EEV aisladas durante el brote de 1992 y las aisladas en 1997 en la misma regi�n por lo que se requieren m�s aislamientos de virus end�micos para establecer una correlaci�n entre las cepas end�micas y epid�micas de la EEV, y reconocer los posibles ancestros comunes de las cepas epid�micas.

Palabras Clave: EEV; end�mico/enzo�tico; epid�mico/epizo�tico; t�cnicas de identificaci�n del virus; �rbol filogen�tico.

INTRODUCCI�N

La Encefalitis Equina Venezolana (EEV) es una enfermedad viral, transmitida por mosquitos infectados que afecta a los �quidos y a los humanos (Fenner et al, 1987; Strauss and Strauss, 1988). Esta enfermedad deja secuelas neurol�gicas as� como ocasiona da�os fatales en los humanos; de hecho, durante la epizoodemia ocurrida en Venezuela en 1962, entre los meses de octubre y diciembre, se presentaron 6.762 casos en humanos con 43 defunciones (Avil�n- Rovira, 1972, 1996). As� mismo, la epizootia iniciada en Ecuador durante 1968 se distribuy� hacia las regiones norte, centro y costa del continente americano hasta llegar a Texas (USA), muriendo entre 30 000 y 50 000 equinos, lo que afect� a la econom�a rural, ya que muchos campesinos utilizaban estos animales para las tareas agr�colas y transporte de productos (Acha y Szyfres, 1992).

Por otra parte, es bien conocida entre los arbovirologos la interrogante sobre el origen y mantenimiento de las cepas virulentas de la EEV en los per�odos interepizo�ticos que producen epidemias en formas espor�dicas, surgiendo varias hip�tesis del mecanismo de re-emergencia de estas cepas de la EEV, entre ellas: una transmisi�n poco intensa del virus de un equino a otro; el virus se propagar�a con lentitud hasta tanto haya una gran poblaci�n equina susceptible y se den las condiciones para una epizootia (Sudia, 1972).

Otra posibilidad es que existen concentraciones bajas de virus epizo�tico en poblaciones de cepas enzo�ticas que pueden iniciar un ciclo epizo�tico visible mediante una combinaci�n de selecci�n aleatoria y pases fortuitos a trav�s de mam�feros sensibles, incluidos �quidos y humanos, que producen concentraciones de viremias elevadas, capaces de infectar vectores pocos eficaces (Dickerman et al., 1987).

Tambi�n es posible una re-emergencia de virus epizo�tico seguido de la administraci�n de preparaciones de vacunas inadecuadamente inactivadas. (Kinney et al., 1992), o el mantenimiento del virus epizo�tico en ciclos de transmisi�n silente similar al de los virus enzo�ticos (Stanick et al, 1989).

Una �ltima hip�tesis postula que las cepas v�rales epizo�ticas/epid�micas derivan o tienen un ancestro com�n enzo�tico similar a la variante ID (Walton y Grayson, 1988; Rico- Hesse et al., 1988). Esta �ltima se basa en la mutaci�n y selecci�n de cepas v�rales enzo�ticas, que pueden amplificar el ciclo selv�tico local, cuando las condiciones son favorables, tales como estaci�n lluviosa, con inundaciones y suficiente poblaci�n de vertebrados susceptibles, as� como vectores.

Esta predicci�n se ha venido verificando a trav�s de an�lisis filogen�ticos, mediante secuencias gen�ticas de las cepas enzo�ticas y epizo�ticas, as� como  por el mapeo de oligonucle�tidos del RNA gen�micos de los virus de la EEV, sugiriendo que los virus epizo�ticos IAB e IC pudieran resultar de mutaciones de cepas v�rales enzo�ticas, subtipo ID y/o IE. Estos hallazgos apuntan la existencia de un progenitor com�n para los virus IAB e IC (Trent et al.,  1979; Kinney et al., 1992, 1993; Rico-Hesse et al., 1988; Strauss and Strauss 1988: Weaver et al., 1992; Sneider et al., 1993). Esta hip�tesis est�  apoyada por la cercana relaci�n antig�nica y gen�tica existente entre las variedades epid�micas IAB/IC y la variedad ID de los virus de la EEV Johnson and Martin, 1974; Walton and Grayson, 1988; Rico-Hesse et al., 1988; Weaver et al., 1992).

An�lisis filogen�ticos de los virus de la EEV, a partir de cepas representativas de  todas las variedades aisladas hasta la fecha, han sido generadas a partir de secuenciaciones parciales del genoma, proporcionado la primera evidencia concluyente del origen de las cepas epizo�ticas/epid�micas del virus  de la EEV (Rico-Hesse et al., 1988).

El objetivo de esta investigaci�n fue aislar virus enzo�tico/end�mico de  la EEV en �reas que favorecieran la circulaci�n de los mismos, la caracterizaci�n de las cepas por m�todos serol�gicos convencionales y por biolog�a molecular, as� como relacionar las cepas aisladas con las cepas de virus de la EEV que circularon durante 1992 y 1995.

MATERIALES Y M�TODOS

�rea de estudio:  La parroquia Jos� Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo en el estado Zulia, Venezuela, fue seleccionada por ofrecer ambientes ecol�gicos favorables para la circulaci�n y mantenimiento de las capas enzo�ticas/end�micas de EEV, y de acuerdo a los resultados serol�gicos preliminares obtenidos durante 1995-1996.

Colocaci�n de h�msters centinelas:  Mil siete h�msters dorados, Mesocricetus auratus, procedentes de las colonias del Instituto de Medicina  Tropical de la Universidad Central de Venezuela y del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", fueron colocados en jaulas suspendidas (0,5 y  l,0 m de altura) y expuestos a las picaduras de los mosquitos en ambientes de bosque h�medo tropical, zonas anegadizas y sombreadas del municipio seleccionado. A los animales se les coloc� agua, alimento y fueron chequeados dos veces al d�a durante 10 d�as.

Cuando los h�msters comenzaban a enfermar y/o morir, eran retirados de las jaulas para la extracci�n de sangre y/o v�sceras. Todas las muestras, previa identificaci�n del animal y de la localidad, eran colocadas en crioviales para su almacenamiento en nitr�geno l�quido o en hielo seco a -70 �C hasta su procesamiento en el laboratorio.

Los animales sobrevivientes, luego de un per�odo de observaci�n, eran sangrados y posteriormente las muestras eran sometidas a estudios serol�gicos para la detecci�n de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinaci�n (IHA) y anticuerpos seroneutralizantes en cultivos celulares (SN).

Capturas de mam�feros. En las mismas localidades en que eran ubicados los h�msters, se colocaron 55 trampas Tomahawk durante tres noches/localidad. Se utiliz� como se�uelo conchas de pi�a, pl�tano maduro y naranja, para atraer a los peque�os mam�feros presentes en los h�bitats de bosque h�medo tropical.

Capturas de mosquitos. Fueron colocados 6 trampas CDC en diferentes puntos del �rea en estudio, para la captura de mosquitos. Se consideraron exclusivamente los mosquitos hembras para la clasificaci�n entomol�gica y para realizar estudios virol�gicos.

 Procesamiento de las muestras: �rganos (h�gado, coraz�n, bazo) procedentes de roedores silvestres capturados, as� como de los h�msters enfermos o reci�n fallecidos y de los pool de mosquitos, fueron procesados en Buffer Phosfato pH 7,2 m�s bovoalbumina al     7,5%, para una concentraci�n final al 10%. Las suspensiones a110% de �rganos y mosquitos, as� como los sueros procedentes de h�msters enfermos y roedores silvestres fueron inoculados con c�lulas VERO E6  y/o ratones lactantes de tres d�as de nacidos, por v�a intracerebral, para evidenciar efectos citop�ticos o enfermedad, respectivamente.

Pruebas de laboratorio. La identificaci�n preliminar se realiz� a trav�s de la t�cnica de fijaci�n de complemento (FC), adaptada a la microt�cnica de Saber (1962) y mediante la t�cnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) descrita por Gardner y Maquillan (1974). Se utilizaron l�quidos asc�ticos hiperinmunes para los grupos A, B, C y Buyamwera suministrados y producidos por el laboratorio de Arbovirus del Instituto de Investigaciones Veterinarias; de referencia, anticuerpos monoclonales para los virus de la EEV, EEE y EEO, suministrados por Yale Arbovirus Reseach Unit y monoclonales para el complejo del virus de la EEV, suministrados por el Centro para el Control de las Enfermedades (CDC) de Fort Collins Co. (5B4C-6; IAIB-9; IA3B-9) y monoclonales para el complejo de EEE (6B6B-I) y para EEO (2A6C- 7). La subtipificaci�n fue realizado mediante el uso de anticuerpos monoclonales para el virus de la EEV y la amplificaci�n de los virus aislados se realiz� mediante la t�cnica de Reacci�n en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa Reversa (PCR-RT).

Reacci�n en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa Reversa. Los virus aislados fueron analizados gen�ticamente por PCR-RT amplificando unos 851 pares de bases del genoma que incluye parte del gen E3 y la mitad 5'terminal del gen de la glicoprote�na de envoltura E2 (posiciones 8390- 900610). El producto del PCR-RT fue secuenciado usando un Secuenciador automatizado Applied Biosystems y el an�lisis filogen�tico mediante el PAUP parsimony algoritmo (Swofford y Paup, 1991) y los programas filogen�ticos PHYLIP (Felsenstein, 1985, 1990).

RESULTADOS Y  DISCUSI�N

Exposici�n de h�msters centinelas y estudios filogen�ticos: En el Cuadro 1 se muestra la distribuci�n de h�msters expuestos en la parroquia Jes�s Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo, observ�ndose que de un total de 1.007 (10.070 h�msters-noche), se aislaron tres cepas del virus de la EEV, ubicados en las fincas Las Nubes y R�o Claro de esa parroquia. Los h�msters enfermaron tres d�as despu�s de la exposici�n, mostrando s�ntomas compatibles con la encefalitis por arbovirus: se observaban quietos o con pocos movimientos, ojos lagrimosos, pelos erizados, hipersensibilidad al tacto y fotofobia.

Suspensiones de �rganos y sueros procedentes de los animales enfermos fueron inoculados en los sistemas susceptibles: c�lulas Vero y ratones lactantes, evidenci�ndose efecto citop�tico o enfermedad, respectivamente en un per�odo de 36-48 horas. La tipificaci�n fue realizada mediante las t�cnicas de FC y por IFI, reaccionando con los l�quidos asc�ticos hiperinmunes y de referencia para el grupo "A" (Togavirus) de los arbovirus.

CUADRO 1. Distribuci�n de h�msters expuestos para aislamiento viral en la parroquia Jes�s Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo, estado Zulia 1996-1997.

Localidad / Fecha
Exposici�n

No. H�mters
Expuesto

 No. H�mters Enf./Muertos

No. H�mters
Sobrevivientes

 Aislamientos  viral/Serolog�a

Santa Rosa
24/2/96

12

Ninguno

 12

Negativo/Negativo

Ca�o Rosario
24/2/96

14

Ninguno

14

Negativo/Negativo

Madre Vieja   I 
24/2/96

14

Ninguno

14

Negativo/Negativo

Agropec.Viviani
14/4/96

40

3

37

1 Positivo Grupo
A; 2 Grupo C/Neg.

Socoavo
13/4/96

30

18

12

2 Positivo Grupo
C/ Negativo

 Madre Vieja I 
14/4/96

30

5

25

 2 Positivo Grupo
C/ Negativo

Madre Vieja II 
14/4/96

33

Ninguno

31

Negativo/Negativo

R�o Claro
13/4/96

28

8

20

8 Positivo Grupo
 C/ Negativo

La Fortaleza
6/6/96

22

Ninguno 

22

Negativo/Negativo

El Porvenir 
6/6/96

21

Ninguno

22

Negativo/Negativo

La Picola
6/6/96

22

Ninguno

22

Negativo/Negativo

Hacienda Mauroa  5/6/96

22

Ninguno

 22

Negativo/Negativo

El Delirio 
30/6/96

70

27

43

 2 Positivo Grupo C

Madre Vieja II
30/6/96

30

20

10

 3 Positivo Grupo C

 R�o Claro I
20/8/96

58

29 

29

 2 Positivo a: Grupo C, 1 Grupo A/ Neg

R�o Claro II
20/8/96

52

19

33

 2 Positivo a: Grupo 
C; 4 Grupo A/ Neg.

Madre Vieja I
20/8/96

 9

Ninguno

9

Negativo/Negativo

Madre Vieja II
20/8/96

30

30

Ninguno

Negativo/Negativo

Agropec. Ceres
20/8/96

30

30

Ninguno

10 Positivo
 Grupo C/Negativo

 Madre Vieja I
7/12/96

10

Ninguno

10

 

 Madre Vieja II 
7/12/96

 30

 3

27

Negativo/Negativo

R�o Claro I
8/12/96

29

 8

19*

Negativo/Negativo

 R�o Claro II
8/12/96

30

12

16*

Negativo/Negativo

 Las Nubes
8/12/96

  60

47

13

Negativo/Negativo

Las Nubes 
20/1/97

114

108

6

Negativo/Negativo

R�o Claro I
26/2/97

60

21

39

1 Positivo a Grupo
Guama

R�o Claro II
26/2/97

60

12

48

 2 Positivo  a* EVV

Las Nubes
26/2/97

60

6

54

l Positivo a* EVV
1 Grupo C/Neg.

Total

1020

406

609

42 Grupo C; 3EVV; 1 Guama, 6 Grupo A .

*Virus de encefalitis equina venezolana (EEV).

                                   

Posteriormente, estas muestras fueron analizadas mediante el uso de anticuerpos monoclonales para los virus de las EEV, EEE y EEO, identific�ndose como pertenecientes al complejo del virus de la EEV; luego, por IFI y mediante el uso de anticuerpos monoclonales espec�ficos a las cepas enzo�ticas y epizo�ticas de EEV, se determin� que el aislado pertenec�a a una cepa enzo�tica /end�mica variedad ID.

Se aislaron otros arbovirus a partir de los h�msters centinelas, tal como: virus UNA, Pixuna, Mayaro, Ilheus, virus perteneciente al grupo C aun no clasificado y virus Guama (Cuadro 1). Los estudios filogen�ticos revelaron que los aislados de la EEV, durante 1997, en la parroquia JMS, corresponden a cepas end�micas ID identificadas como IDZPC231 y IDZPC260 y las mismas formaron grupos monofil�ticos con otras cepas de la EEV identificadas tambi�n como ID (Figura 1).

FIGURA 1. �rbol fitogen�tico de las cepas de virus de la EEV y las cepas aisladas en la paroquia Jes�s Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo, estado Zulia 1996-1997

FIGURA 1. �rbol fitogen�tico de las cepas de virus de la EEV y las cepas aisladas en la paroquia Jes�s Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo, estado Zulia 1996-1997.

Captura de mosquitos. No hubo aislamiento viral para ning�n arbovirus a partir de las suspensiones preparadas. Sin embargo, la din�mica poblacional tuvo una mayor proporci�n para el genero Culex melanoconium spp. representando un 40% del total de mosquitos capturados, mientras que el �ndice de dominancia observado fue 70%, compartido entre el Culex melanoconium spp. y el Culex culex spp., ambos g�neros, involucrados en los ciclos de transmisi�n enzo�tica/end�mica del virus de la EEV. Otros mosquitos, capturados en menor proporci�n, fueron de los g�neros Mansonia, Psorosphora y Aedes (Cuadro 2).

Cuadro 2. Frecuencia absoluta y porcentual de mosquitos capturados en diferentes localidades de la parroquia Jes�s Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo, estado Zulia 1996-1997.

Mosquitos Sta. Rosa Ca�o
 Rosario 
 Madre
Vieja
Agrop.
Viviana
Total %
C. melanoconium spp. 67  594   795  0 1556 40,0
M. titilans 66  23 0 91 2,3
C.culex mollis 170  242 612  0 1024 26,3
P. ferox 1 0 1 0 2 0,05
A. scapularis 49  0 0 0 49 1,25
P. varipens 20 0 0  0 20  0,51
C. nigripalpus 0 66 295 0 361 9,28
A. serratus  0  0 50 51 1,3
A. fulvus 0 0 1 0 1 0,02
C. spp 0 305 100 405  10,4
C. declaractor 0 0 0 100 100   2,6
C. bidens 0 0 0  206  206  5,3
P. albipens  0 0 21 21 0,53 
A. nigricans 0 0 0 2 0,05
M. venezuelensi 0 0 0 1 1 0,02

Captura de roedores silvestres. El Cuadro 3 muestra la distribuci�n de roedores silvestres capturados en la parroquia JMS, municipio Catatumbo. No hubo aislamiento viral para ninguno de los arbovirus y tampoco se evidenciaron anticuerpos IHA o SN en las muestras analizadas para la EEV. Estos resultados evidenciaron la baja densidad poblacional de peque�os mam�feros en estas �reas, los cuales son las fuente principal para la multiplicaci�n y mantenimiento de las cepas enzo�ticas en h�bitats de bosque h�medo tropical. Durante el estudio, tambi�n se observ� la deforestaci�n de amplias zonas boscosas, lo cual implica rotura del equilibrio ecol�gico y migraci�n de animales hacia otras zonas que permitan su mantenimiento y reproducci�n en la naturaleza.

CUADRO 3. Distribuci�n de roedores silvestres capturados en la parroquia Jes�s Mar�a Sempr�m, municipio Catatumbo estado Zulia 1996-1997.


Localizaci�n 
Fecha. Exp.
No
Trampas
Tomahawk
No. Reservorios
capturados
Especie AV/ Ser.

Santa Rosa
24/2/96

7

2 Rabipelados Didelphis spp.  Negativos
Ca�o Rosario.
24/2/96
7 1 Rabipelado
1 Rata Casiragua
 Didelphis spp
Ratus ratus spp.
 Negativos
Madre Vieja I
24/2/96
7 No hubo captura
Agrop. Viviani
13/4/96
14 No hubo captura
Madre Vieja II  
7/12/96
10 2 Ratas Casiraguas
4 Rabipelados
 2 Ratones
2 Ratus ratus spp.
4 Didelphis spp.
Mus muscularis spp
Negativos
Negativos
Negativos
Madre Vieja I
8/12/96
l0 2 Ratas Casiraguas 2 Ratus ratus spp. Negativos
Total 55   6 Rabipelados
5 Ratas Casiraguas
2 Ratones
6 Didelphis spp.
2 Ratus ratus spp.
2 Mus muscularis spp.
Todos Negativos a serolog�a y aislamiento viral

 AV/Ser.=Aislamiento viral serol�gico

Estudios Fitogen�ticos. Tres cepas de virus de la EEV, subtipificadas como ID, fueron aisladas en febrero de 1997. En el �rbol (Figura 2), estas cepas est�n identificadas como ZPC231 y IDZPC260. Al tomar el producto del PCR -RT para secuenciar y posteriormente construir el �rbol filogen�tico con las cepas de virus, se evidencia que las cepas aisladas formaron grupos monofil�ticos con las cepas ID VE76, VE81 y guardaban una estrecha relaci�n con las cepas ID CO83. (Resultados proporcionados por la Universidad  de Texas Medical Branch en Galveston, Departamento de Patolog�a, coordinado por el Dr. Scott Weaver).

FIGURA 2. �rbol filogen�tico de las cepas de virus de la EVV aisladas durante el brote de 1992 (tomado de Rico-Hesse et al., 1995).

FIGURA 2. �rbol filogen�tico de las cepas de virus de la EVV aisladas durante el brote de 1992 (tomado de Rico-Hesse et al., 1995).

Las cepas de virus de la EEV aisladas durante el brote epid�mico en Venezuela durante 1992-1993 formaron grupos monofil�ticos y est�n estrechamente relacionadas con la cepa ID aisladas en 1981 y 1983, consider�ndose que los virus end�micos de la EEV que circulan al noroeste de Colombia y noreste de Venezuela generan, v�a mutaci�n, cepas epid�micas IC (Figura 3).

FIGURA 3. �rbol fitogen�tico de las cepas de virus de la EVV aisladas durante la epidemia del 1995 (tomado de Weaver et al., 1996).

FIGURA 3. �rbol fitogen�tico de las cepas de virus de la EVV aisladas durante la epidemia del 1995 (tomado de Weaver et al., 1996).

Los virus de la EEV que circularon en Venezuela durante 1995 formaron grupo monofil�tico con los aislados de EEV de 1962-1964 y estaban m�s estrechamente relacionados al aislamiento viral de mosquitos en Panaquire, estado Miranda. No hubo correlaci�n entre los aislados epid�micos de 1992 y 1995 (Figura 3).

Los tres aislamientos del virus de la EEV correspondientes a cepas end�micas/enzo�ticas, variedad ID, en la parroquia JMS, municipio Catatumbo, sugieren que los ciclos silvestres para la EEV se mantienen en forma contin�a y con intensidad variable, dependiendo de ciertas condiciones ambientales, ecol�gicas y climatol�gicas.

Cepas v�rales de la EEV aisladas en ambientes de bosque h�medo tropical, han sido halladas por Walder and Su�rez (1976), en la regi�n de Catatumbo, por Querales et al. (1985) en Panaquire, estado Miranda y por Dickerman et al. (1987), al norte de Colombia. El reconocimiento de circulaci�n de otras cepas de virus pertenecientes a Mayaro, Ilheus, UNA, Virus Grupo "C" y Guama en las mismas �reas o cercanas donde circulan las cepas end�micas de la EEV permite inferir que estos virus comparten sus nichos ecol�gicos y, en consecuencia, existe una fuerte competencia entre ellos y sus vectores para la persistencia y mantenimiento de los mismos en peque�os focos.

 Walter et al., 1984; Dickerman et al., 1987; Rico-Hesse et al., 1988 se�alan que la persistencia de focos enzo�ticos de la EEV y los mismos se encuentran a peque�as distancias uno de los otros en ambientes de bosque h�medo tropical. En consecuencia, el aislamiento de cepas virales de la EEV depender� de la expansi�n o retracci�n de los nichos ecol�gicos, de la poblaci�n de vectores, de la densidad poblacional de peque�os mam�feros y de los cambios ecol�gicos que se presentan en dichas �reas.

No hubo aislamiento viral a partir de mosquitos ni reservorios silvestres para el virus de la EEV, as� como tampoco se detectaron anticuerpos mediante la t�cnica de IHA. Los resultados obtenidos a partir de los estudios entomol�gicos demostraron, que el �ndice de dominancia estuvo compartido entre los g�neros de los mosquitos C. melanoconium spp. y  C. culex spp. Investigaciones hechas por Walter and Su�rez, 1976 y 1984; Scherer et al., 1971, 1975 y 1976; Sudia et al., 1972, 1975; Walton and Grayson 1988 y Cupp et al., 1979 se�alan que ambos vectores est�n involucrados en los mecanismos de transmisi�n end�micos del virus de la EEV.

 Los estudios filogen�ticos de las cepas aisladas, a partir de h�msters centinelas apoyan la teor�a de que los virus epizo�ticos/epid�micos derivan de un ancestro com�n end�mico y se requieren condiciones locales que permitan mutaciones aleatorias en las secuencias de amino�cidos. Esta teor�a hasta la fecha ha sido demostrada para ciertos linajes de cepas end�micas ID y IE. Secuenciaciones parciales del genoma de diferentes  cepas representativas , del virus dc la EEV realizadas por Weaver et al., 1990, 1992, y 1996; Rico -Hesse et al., 1988 y 1995 han revelado  que  las cepas aisladas durante  el  brote epid�mico  en Venezuela durante 1992-1993 formaban grupos monofil�ticos y est�n  estrechamente relacionado con la cepa ID aislada en 1981, 1983 (Figura 1) y los aislados de 1997 identificados en el �rbol  geneal�gico como  ID ZPC260 y ZPC231 (Figura3) en Venezuela y Colombia  respectivamente; mientras que el  virus dc la EEV que circul� en Venezuela durante 1995, form� grupo  monofil�ticos con los aislados dc la EEV dc 1962-1964 y estaba  m�s estrechamente  relacionado al l aislamiento viral de mosquitos en Panaquire  estado Miranda (Figura 2). La posici�n ancestral de los virus enzo�ticos  en el �rbo1 geneal�gico apoyan y concluyen, que los virus epid�micos de la EEV emergen de h�bitats dc transmisi�n dc cepas enzo�ticas. Sin embargo, se requieren m�s aislamientos  v�rales a partir de  h�bitats enzo�ticos, de diferentes regiones del pa�s y secuencias adicionales de estas variedades para identificar con mayor precisi�n  los progenitores, de los virus variedad  IC de la EEV.

 AGRADECIMIENTO

Los autores  desean manifestar su agradecimiento por su valiosa colaboraci�n en la ejecuci�n de este trabajo, a: Luis Enrique P�rez, Luis Antonio Rodr�guez, Josefina Blanco y Zenovia Vargas de Mart�nez; y a, Fundacite  Aragua, Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", Endemias Rurales de Maracay y XV Regi�n de Malariolog�a del estado Zulia

SUMMARY

In order to isolations enzo�tic/end�mic virus of the venezuelan equine encephalitis (VEE) and to establish a correlation between epizootics/epidemics viruses acting during 1992-1995 and the enzootics/endemics straing isolated from ecological niches, an investigation was made in the parish Jesus Maria Sempr�m (JMS), Catatumbo municipality of zulia State. Methodology was based on the exposition of sentinels hamsters, isolation and identification of viruses in sick animals, collection, classification and indentification of viruses in sick animals, collections, classification and viral isolations from mosquitoes, and capture and bleeding of smalls rodents. techniques used for the identification of isolated viral straing were: complement fixation and indirect inmunofluorescence, as wll as were as reverse Polymerasa-Transcriptasa chain reaction technique (PCR-RT), and sequencing and phylogenetic analysis. the results of this investigation provided three isolations of VEE viruses indentified as ID in the locality of Rio Claro and Las Nubes of JMS parish during the month of February 1997; indicating that the enzo�tic /end�mic transmission of the EEV viruses variety ID still active in Catatumbo in spite of the significant ecologial changes produced in the tropical forests. Viral strains isolated in February 1997 in Catatumbo; however a correlation exists between the strains of VEE viruses isolated during the 1992 outbreak and the ones isolated in 1997  in the same region, which suggests that more endemic VEE virus isolations are required in order to stablish correlation between the endemic and epidemics strains of VEE and to recognize the possible common ancestros of the epidemics strains.

 Key  Words: VEE; endemic/enzootic; epidemic/epizootic; PCR; philogenetic tree.

BIBLIOGRAF�A

ACHA, P y B. SZYFRES. 1992. Zo�nosis y enfermedades transmisibles, comunes al hombre y a los animales. 2a. ed. Organizaci�n Panamericana de la Salud. Publicaci�n Cient�fica N� 503. pp. 382-387.

AVIL�N-ROVIRA, J.1972. Epidemiolog�a de las encefalitis en Venezuela seg�n las estad�sticas de mortalidad. Tribuna M�dica 1972: 36:5-16.

DICKERMAN, R., A. CUPP, A. GROOT, E. MORALES, A. CURA, A. DICKERMAN, R. IBAYOS, R. RICO-HESSE, C. TAYLOR  y  S. WEAVER. 1987. Actividad del virus de encefalitis equina venezolana en el norte de Colombia (Abril-Mayo de 1983). Bolet�n de la Oficina Panamericana 103(1): 1-20

FELSENSTEIN, J. 1985 Confidence limits on phylogenies an approach using the bootstrap. Evolution, 39:783- 7991.

FELSENSTEIN, J. 1990. PHYLIP manual. University Herbarium, University of California version 3.3.

FENNER, F., P. BACHMUNN and E. GIBBS, 1987. Togavirus and Flavivirus. Veterinary Virology: 451-470.

GARDNER, P. S. and J. McQUILLAN. 1974. Rapid virus diagnosis: application of immunof1uorescence. London. Butterworth and Co. 

JOHNSON, K. M. and D. H. MARTIN. 1974. Venezuelan equine encephalomyelitis. Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 18:79.

KINNEY, R., R. TUSUCHITA, J. SNEIDER and D. TRENT. 1992. Molecular evidence for the origin of the widespread Venezuelan Equine Encephalities epizootic of 1969 -1972. Journal of General Virology 73:3301-3305.

KINNEY, R., R. TUSUCHITA, .J. SNEIDER and D. TRENT. 1993. Molecular evidence the epizootic Venezuelan Equine Encephalities (VEE) IAB viruses are not evolutionary derivations of enzootic VEE subtype I-E of II viruses. Journal of Virology.

KINNEY, R., R.TSUCHIYA, J. SNEIDER and D. TRENT. 1992. Genetic evidence the epizootic Venezuelan Equine Encephalytis (VEE) virus may have envolved from enzootic VEE subtipo I-D virus. Virology 191:569-580.

QUERALES, J., J. PLAZ, H. FERN�NDEZ y F. ACIVE. 1985. Estudio seroepidemiol�gico de encefalitis por virus venezolano en la regi�n de Barlovento. Re. Inst. Nac. Higiene 28(2):43-49.

RICO-HESSE, R., ROEHRIG. D. TRENT and R. DICKERMAN. 1988. Genetic variation of Venezuelan Equine Encephalities virus strain of the ID variety in Colombia. American Journal Tropical Medicine and Higiene 38(1):195-204.

RICO-HESSE, R., S. WEAVER, J. SIGER, G. MEDINA and R. SALAS. 1995. Emergence a new epidemic/epizootic Venezuela equine encephalitis virus in South America. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 92:5 278-5 281.

SA VER, J. L. 1962. Aplication of a microtechnique to viral serological investigation. J. Inm. 88: 320-329.

STANICK, D. R., M. WIEBE and W. F. SHERER. 1985. Markers of Venezuelan encephalitis virus which distinguish enzootic strains ID from those of IE. Am. J. Epidem.122:234-244.

SCHERER, W., E. DICKERMAN, S. JORD�N, M. SAIDI, L. ZARATE and K. VENTURA. 1971. Ecologic studies of Venezuelan encephalitis virus in southeastem Mexico. II. Prevalence, and geographic and temporal distribution of virus measured by sentinel h�msters and mice. Am J. Trop. Hyg. Med. 20:740- 743.

SCHERER, W. F., J. DICKERMAN, J. ORDO�EZ, C. SEYMOUR, L. KRAMER, P. JAHRLING and C. POWERS. 1976. Ecology studies of Venezuelan Encephalities virus and isolations of Nepuyo and Patois virus during 1968-1973 at the marsh habitant near the epicenter of the 1969 outbreak in Guatemala. American Journal of Tropical Medicine and Higiene 251(1): 151-162.

SCHERER, W. F., J. ORDO�EZ, R. W. DICKERMAN and J. E. NAVARRO. 1976. Search for persistent epizootic Venezuelan encephalitis virus in Guatemala, El Salvador, and Nicaragua during 1970-1975. Am. J. Epidemiology. Vo1 104. N� 1,60- 73.

SNEIDER, J., R. KINNEY, K. TSUCHIYA and D. TRENT. 1993. Molecular evidence the epizootic Venezuelan Equine Encephalities (VEE) I- AB viruses are not evolutionary derivations of enzootic VEE subtype IE or it viruses. Journal of General Epidemiology 74:514-523.

STRAUSS, J. and E. STRAUSS, 1988. Evolution of RNA viruses. Ann. Review Microbiology 42:657-683.

 SWOFFORD, D. L. 1991. PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony version 3.0. Champaing, Illinois: Illinois Natural History Survey, p. 257.

SUDIA, W. D. 1972. Arthropod vectors of epidemic Venezuelan equine encephalitis. In: Proc. Workshop. Symposium on Venezuelan Encephalitis Virus.Sci. Publi. 243. Pan American Health Organitation, Washington, DC, 157.

SUDIA, W ., L. FERN�NDEZ, V. NEWHAUSE, R. SANZ and CH. CALISHER. 1975. Arboviruses vector ecology studies in M�xico during the 1972. Venezuelan Equine Encephalities outbreak. American Journal of Epidemiology 101:51-58.

TRENT, D., J. CLEWLEY, J. FRANCE and D. BISHOP, 1979. Inmmunochemical and oligonucleotide fingerprint analysis of Venezuelan Equine Encephalomyelitis complex virus. Journal General of Virology 43;365-381.

WALDER, R., and O. SU�REZ.1976. Studies of arbovirus in southwestern Venezuelan; I Isolations of Venezuelan and eastern equine encephalitis viruses from sentinel h�msters in the Catatumbo region. Int. J. Epidmiology. 5:375-384.

WALDER, R.,O. SU�REZ and CH. CALISHER. 1984. Arbovirus studies in the Goajira regi�n of Venezuela; activities of Eastern Equine Encephalities viruses during an interepizootic period. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 33(4):699- 707.

WALDER, R., O. SU�REZ and CH. CALISHER. 1984. Arbovirus studies in South western Venezuela during 1973-1981. III. Isolations and further studies of Venezuela on Eastern Equine Encephalities, Una, Iraqu� and Moju viruses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 33(3);483-491.

WALTON, T. and K. JOHOMIK. 1972. Epizootiology of Venezuelan Equine Encephalomyelitis in the Americas. Journal of the American Veterinary Medical Association 161;1 509-1 515.

WALTON, T. E. and M. A. GRAYSON.1988. Venezuelan equine encephalomyelitis, In: T. P. Monath (ed.) The Arbovirus; Epidemiology and Ecology . Boca Raton, Florida. CRC Press. IV. p. 203-233.

WEAVER, S., T. SCOTT and R. RICO-HESSE. 1990. Molecular evolution of Eastern Equine Encephalomyelities virus in North America. Virology 0181:774- 784.

WEAVER, S., L. BELLES and R. RICO-HESSE. 1992. Phylogenetic analysis of Alfaviruses in the Venezuelan Equine Encephalities complex and identification of the source of epizootic viruses. Virology 191;282-290.

WEAVER, S. C., R. SALAS, R. RICO-HESSE, G. LUDWING, M. OBERSTE, J. BOSHELL and R. TESH. 1996. Re- emergence of epidemic Venezuelan equine encephalomyelitis in South America. The Lancet. Vol 348. p. 436-440.

WEAVER, S. 1996. Proyecto de EEV. "Mecanismos de Emergencia de los virus de Encefalitis Equina venezolana". 86 p. (Mimeo).

YOUNG, N. and K. JOHNSON. 1969. Antigenic variants of Venezuelan encephalitis virus their geographic distribution and epidemiologic significance. Am. J. Epidemiology. 89:286-307.