Veterinaria Trop. 26(1): 35-46. 2001

PRIMER AISLAMIENTO E IDENTIFICACI�N DEL AGENTE CAUSAL DE BORDETELOSIS AVIAR Y REPRODUCCI�N DE LA ENFERMEDAD EN VENEZUELA

 Carmen de Noguera*, Dilia Infante*, Antonio J. Le�n*,  Jos� G. Fern�ndez***, 
Morela de Rolo*, Irma Avila**** y Antonio Herrera**

* Investigadores y **T�cnicos Asociados a la Investigaci�n. lNIA.
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP).
Instituto de Investigaciones Veterinarias. Apdo. 70.
 Maracay 2102, estado Aragua. Venezuela.
 * * * Licenciado en Bioan�lisis. Centro de Servicios T�cnicos-WIMCO-CALA.
Maracay, estado Aragua. Venezuela.
* * * * Profesora. U niversidad de Carabobo.
Facultad de Ciencias de la Salud. Escuela de Medicina.
 Dpto. Microbiolog�a. N�cleo Aragua. Venezuela.

 Recibido: agosto 30, 2001.

  RESUMEN

Se present� una enfermedad de las v�as respiratorias superiores en pavos de 5 semanas de edad. Los signos cl�nicos incluyeron estornudos, descarga nasal, disnea, respiraci�n por la boca, y exudado espumoso en los ojos; la morbilidad fue de 100% sin mortalidad.  A la necropsia presentaron tr�queas colapsadas con exudado mucoso. Se tomaron hisopados traqueales que fueron sembrados en tripticasa soya sangre agar y MacConKey agar al 2,5%, infusi�n cerebro coraz�n, caldo infusi�n de ternera y caldo triptosa.  Se inocularon pavitos de un d�a v�as intranasal y ocular, con una dosis de 10⁶ unidades formadoras de colonia de la cepa P:6502. De los hisopados traqu�ales del brote natural se aisl� un bacilo gram negativo, m�vil, aerobio estricto no fermentador. En MacConKey produjo colonias lisas con un centro marr�n a las 48 horas y filamentos en medios l�quidos, catalasa y oxidasa positivos, ureasa y reducci�n de nitratos negativos. El estudio de las caracter�stica macrosc�picas y microsc�picas de las colonias y las pruebas bioqu�micas identificaron este aislamiento como Bordetella avium. Los pavos infectados experimentalmente mostraron s�ntomas respiratorios a partir del segundo d�a post inoculaci�n. Los inoculados v�a nasal presentaron morbilidad de 80% y mortalidad de 60%. B. avium fue recuperada de los pavos enfermos y muertos. Los hallazgos de este reporte coinciden con las caracter�sticas de B. avium y con los brotes cl�nicos de bordetelosis de los pavos. El aislamiento de B. avium y la reproducci�n de la enfermedad en ellos, permite concluir que la enfermedad respiratoria corresponde a un brote de bordetelosis.

Palabras Clave: Bordetelosis; Bordetella avium; infecci�n experimental.

INTRODUCCI�N

 La infecci�n por Bordetella en aves fue descrita por primera vez en Canad� por Fili�n et al., 1967. Posteriormente, a mediados de la d�cada de los 70, se present� en los Estados Unidos y Alemania un s�ndrome similar conocido como coriza de pavos, rinotraque�tis y bordetelosis.

Bordetella avium originalmente fue clasificada como Bordetella bronchiseptica-like o Alcal�genes faecalis , sin embargo, estudios posteriores realizados por Kersters et al. (1984), concluyeron que el agente causal correspond�a a una nueva especie del g�nero  Bordetella a la cual se denomin� B. avium. Aunque su hu�sped natural son los pavos, tambi�n se ha presentado en pollos y otras especies aviares (Kersters et al., 1984; Kelly et al.,1985; Blackall y Farrah, 1985; Blackall y Doheny, 1987; Jackwood et al., 1995).

La bordetelosis de los pavos es una enfermedad de las v�as respiratorias superiores, altamente contagiosa, sobre todo en explotaciones comerciales, y de una importancia econ�mica significativa, ya que las aves afectadas quedan predispuestas a infecciones secundarias. El curso cl�nico de la enfermedad var�a de moderada a severa dependiendo de la presencia de otros microorganismos y condiciones ambientales (Saif et al., 1980; Arp y Skeeles, 1991; Wilding, 1996). 

La infecci�n natural afecta a pavos entre 2 y 6 semanas de edad, con una morbilidad que puede variar de 80 a 100%, mientras que la mortalidad es de 10% (Arp y Skeeles, 1991; Wilding, 1996; Skeeles y Jackwood 1998). 

En pavos j�venes la enfermedad se caracteriza por la aparici�n repentina de estornudos, acompa�ados de abundante descarga nasal, tos seca, respiraci�n por la boca, disnea, exudado espumoso alrededor de los ojos y disminuci�n del consumo de agua y alimento con pobre ganancia de peso (Kelly et al., 1986; Wilding, 1996; Skeeles y Arp, 1997; Skeeles y Jackwood, 1998).

B. avium es un bacilo gram negativo, m�vil, aerobio estricto, no fermentador, oxidasa y catalasa positivos, urea negativa. En medios s�lidos forma colonias puntiformes (0,2-1 mm) a las 24 horas de incubaci�n y en el medio selectivo MacConKey agar muchas cepas producen colonias con un centro marr�n (Kersters et al., 1984; Skeeles y Arp 1987; Skeeles y Jackwood 1998) . En medios l�quidos, se ha descrito la formaci�n de filamentos de varias longitudes (Domingo et al., 1992). Numerosos ensayos se han realizado con el objeto de infectar experimentalmente pavos de diferentes edades, logrando en la mayor�a de los casos reproducir el cuadro cl�nico respiratorio. compatible con bordetelosis entre 4 y 6 d�as post-exposici�n, as� como la recuperaci�n de B. avium de las aves inoculadas (Saif et al., 1980; Gray et al., 1983; Montgomery et al., 1983; Arp et al., 1984; Sacco et al., 2000). 

Algunos autores adem�s relacionan la patogenicidad de B. avium con las caracter�sticas morfol�gicas de las colonias (Jackwood et al., 1985; Jackwood et al.,1995) y con la capacidad de producir formas filamentosas en cultivos l�quidos (Domingo et al., 1992; Jackwood et al., 1995). 

El prop�sito de este trabajo es rese�ar el aislamiento de B. avium, de un brote de Bordetelosis en pavos, as� como la reproducci�n experimental de la enfermedad. 

MATERIALES Y M�TODOS

Muestras. En el laboratorio se recibieron 5 pavos de 5 semanas de edad procedentes de una explotaci�n comercial ubicada en la regi�n capital del pa�s. Los signos cl�nicos observados en las aves fueron tristeza, alas ca�das, plumas erizadas, descarga nasal, estornudos, disnea, respiraci�n con la boca abierta y exudado espumoso en los ojos (Figura 1), con una morbilidad del 100% y sin mortalidad.

El total de las aves fueron necropsiadas y se tomaron muestras de hisopados traqueales, tr�queas y pulm�n. Las muestras de pulm�n y tr�quea fueron procesadas para el aislamiento de los virus de Newcastle (NC) y bronquitis infecciosa aviar (BIA) siguiendo las t�cnicas descritas por Alex�nder ( 1998) y Gelb y Jackwood ( 1998) y los hisopados traqueales para el aislamiento de B. avium.  

Aislamiento e identificaci�n de B. avium. Muestras de hisopados de mucosa traqueal de todos los pavos recibidos se sembraron en los medios de tripticasa soya sangre agar (TSSA) y MacConKey (MCA) con un incremento de 2,5% de agar, infusi�n cerebro coraz�n (ICC), caldo infusi�n de ternera (CIT) y caldo triptosa (CT), siguiendo las t�cnicas descritas por Skeeles y Jackwood (1998).

Para la identificaci�n bioqu�mica se utilizaron las pruebas de catalasa, oxidasa, indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, producci�n de H₂S, reducci�n de nitratos a nitritos, ureasa y malonato siguiendo los procedimientos recomendados por Kersters et al. (1984). 

Para la prueba de fermentaci�n de carbohidratos se utilizaron glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, maltosa, arabinosa, sorbitol, dulcitol, ramnosa y rafinosa a una concentraci�n del l % en agua peptonada. 

Reproducci�n de la enfermedad. Con la finalidad de reproducir el cuadro respiratorio observado en las aves procedentes de la granja, se utilizaron 15 pavos de un d�a de edad, obtenidos de una incubadora comercial, los cuales se dividieron en 3 grupos de 5 cada uno identificados como A, B y C. El grupo A se inocul� por v�a intraocular (IO) con una dosis de 10⁶ de la cepa P:6502. El grupo B se inocul� por v�a intranasal (IN), con el mismo cultivo y la misma concentraci�n y el grupo C (no inoculado) correspondi� a los controles. Las aves fueron observadas durante 10 d�as, llevando registros diarios de los signos cl�nicos y mortalidad. Todas las aves fueron necropsiadas y se tomaron muestras de tr�queas, las cuales se sembraron en medios de cultivo, para la recuperaci�n del agente bacteriano inoculado siguiendo la misma t�cnica utilizada en las aves procedentes de la granja.

RESULTADOS Y DISCUSI�N

 A la necropsia, tres de los pavos de 5 semana presentaron tr�queas colapsadas con exudado mucoso claro; pericardio ligeramente engrosado en dos aves, sacos a�reos abdominales ligeramente turbios y uno con c�seos. Las muestras de pulm�n y tr�quea de los mismos resultaron negativas al aislamiento de los virus de NC y BIA.

De los hisopados traqu�ales de los pavos procedentes de la granja y con signos respiratorios, se aisl� un bacilo peque�o, gram negativo, aerobio estricto, m�vil, oxidasa y catalasa positivas que en TSSA produjo colonias puntiformes no hemol�ticas y en MCA se observaron colonias peque�as de aspecto liso, trasl�cidas, perladas, de bordes regulares a las 24 horas de incubaci�n, que a las 48 h desarrollaron un centro marr�n (Figura 2). Las caracter�sticas morfol�gicas de las colonias obtenidas en este traba.jo coinciden con las colonias tipo I de B. avium descritas previamente por Kersters et al., 1984; Jackwood et al., 1985, Arp y Skeeles 1991. La cepa aislada fue identificada P = 6502.

FIGURA 2. Colonias con centro marr�n, a las 48 horas en agar de MacConkey.

En los medios de cultivo ICC, CIT y CT se observ� crecimiento filamentoso y la formaci�n de una pel�cula en la superficie (Figuras 3 y 4). Domingo et al. ( 1992) se�ala el desarrollo de filamentos de diferentes longitudes en cultivos l�quidos de B. avium.

FIGURA 3. Crecimiento filamentoso de B. avium, en caldo infusi�n cerebro coraz�n.

FIGURA 4. Crecimiento de B. avium, en caldo infusi�n de ternera, con pel�cula en la superficie a las 48 horas.

En el Cuadro se indican las propiedades bioqu�micas de la cepa aislada a partir de los hisopados traqueales de pavos de 5 semanas, las cuales coinciden con las descritas previamente por otros autores, para aislamientos de B. avium (Kersters et al., 1984; Jackwood et al., 1985).

En los pavos inoculados por v�a IO, la morbilidad alcanz� e1 60% pero sin ninguna mortalidad. Los primeros s�ntomas observados a los 2 d�as post-inoculaci�n (PI) fueron tristeza y estornudo. A partir del tercer d�a presentaron ruidos respiratorios y disnea. La secreci�n nasal se manifest� a los 5 d PI y se mantuvo hasta el final del per�odo de observaci�n (10 d); estos resultados son similares a los descritos por Gray et al. (1983); Saif et al. (1980), quienes informan sobre la presencia de secreci�n mucosa entre 4 y 6 d PI en pavos inoculados v�a IN de 1 y 3 d de edad, respectivamente.

Los pavos inoculados IN presentaron una morbilidad de 80% con 60% de mortalidad, la cual ocurri� los d�as 3 y 4 PI. La elevada morbilidad coincide con los informes de Kersters et al. (1984) y Saif et al. (1980), quienes obtuvieron 100% de morbilidad en pavos inoculados IN con B. avium a los 3 d de edad. Estos autores no se�alan mortalidad, mientras que Gray et al. (1983) observaron 20% de mortalidad en pavos inoculados IN al primer d�a de edad y Sacco et al. (2000) quienes probaron la resistencia de varias l�neas gen�ticas de pavos a la infecci�n con B. avium, obteniendo entre 10 y 30% de mortalidad cuando inocularon por v�a IN pavos de un d�a. 

La penetraci�n de la bacteria por v�a IN alcanza m�s r�pido la mucosa oronasal con la posterior adherencia a las c�lulas ciliadas y la colonizaci�n en la porci�n superior de la tr�quea. La diseminaci�n de la bacteria a lo largo de la mucosa respiratoria estimula la inflamaci�n, present�ndose los signos respiratorios y la obstrucci�n nasal, lo cual puede ocasionar la muerte en las aves. Presumiblemente ese proceso pudiera explicar la no mortalidad registrada en las aves inoculados por v�a 10 a pesar de los signos cl�nicos y la recuperaci�n de la bacteria.

Jackwood et al. (1985 y 1995) relacionan la patogenicidad de B. avium con las caracter�sticas de las colonias y la formaci�n de filamentos, se�alando que las cepas lisas son pat�genas para pavos y Domingo et al. (1992), demuestran la patogenicidad de las formas filamentosas. En el presente estudio la cepa inoculada corresponde a la forma lisa y filamentosa, resultando pat�gena para pavos de un d�a, lo cual coincide con los autores antes mencionados. Ninguna de las aves controles present� manifestaciones cl�nicas durante el per�odo de observaci�n. 

De todos los pavos inoculados, tanto por v�a IN como IO, se aisl� en estado puro un bacilo gram negativo, cuyas caracter�sticas morfol�gicas y bioqu�micas coincidieron en su totalidad con el aislamiento original, el cual fue identificado como B. avium, mientras que de los hisopados traqueales de los pavos controles no hubo aislamiento bacteriano. 

Los hallazgos de este trabajo permiten concluir que la cepa aislada P = 6502 de los pavos procedentes de la granja y con s�ntomas de enfermedad en el tracto respiratorio superior correspondi� a B. avium. Esta cepa fue capaz de infectar experimentalmente pavos de un d�a de edad, los cuales presentaron manifestaciones cl�nicas respiratorias y mortalidad compatibles con bordetelosis de los pavos, cumpliendo as� con uno de los postulados de Koch. 

Las manifestaciones cl�nicas de la enfermedad pueden ser confundidas con otros agentes que causan afecciones de las v�as respiratorias superiores, motivo por el cual es indispensable el aislamiento e identificaci�n del agente causal. 

Este aislamiento es el primer reporte oficial de la enfermedad en el pa�s por lo que se recomienda aplicar medidas higi�nico-sanitarias y de prevenci�n y control a fin de disminuir la transmisi�n de la enfermedad entre granjas, as� como la realizaci�n de investigaciones sobre la presencia de la enfermedad en otras explotaciones de pavos, as� como de otros factores que puedan contribuir a la perpetuaci�n de la enfermedad.

 La sobrevivencia de la bacteria en el ambiente de los galpones ayuda a que ocurran ciclos de reinfecci�n (Pardue y Luginbuhl, 1998). La cama y el agua contaminada juegan un papel importante en la transmisi�n de la bacteria.

AGRADECIMIENTOS

 A la Dra. Yuraima Pineda, por su asistencia t�cnica y a Laboratorios Shering Plough Animal Health, por el suministro de medios de cultivo, reactivos y trabajo fotogr�fico.

 SUMMARY

 An upper respiratory disease was observed in a 5 weeks-old turkeys flock. Clinical signs included sneezing, nasal discharge, dyspnea, open-mouth breathing and foamy exudates from the eyes. The morbidity was 100% without mortality. Gross lesions were collapsed trachea with mucous exudates. Swabs of tracheal samples were cultivated on Tripticase Soy blood agar and MacConkey agar 2.5% brain heart infusi�n, veal infusion broth and triptose broth. Day-old poults were inoculated intranasal and intraocular with 10⁶ colony forming units of Bordetella avium strain P:6502. From the tracheales swabs of the natural outbreak, a gram negative, motile, strict aerobic nonfermenting bacillus was isolated. On MacConkey agar, after 48 hours, grow of smooth colonies with brown centers were observed as well as filamentous forms in broth medium, catalase and oxidase positive, urease and nitrate reducci�n negative. According to the characteristics of the colonies and the biochemical tests, this isolation is identified as B. avium. Infected poults, showed respiratory signs two days after the challenge. The intranasal inoculated poults showed 80% of morbidity and 60% mortality. Bordetella avium was recuperated from the sicks and dead poults. The results of this report coincide with B. avium characteristic and with the clinical outbreak of bordetellosis in turkeys. The isolation of B. avium and the reproduction of the disease allow us to conclude that the respiratory disease corresponded with a bordetellosis outbreak.

 Key Words: Bordetellosis; Bordetella avium; experimental infection.

BIBLIOGRAF�A

ALEXANDER, D. J. 1998. Newcastle diseases virus and other Paramyxovirus. In: Swayne, D. E.; J. R. Glisson, M. W Jackwood; J. E. Pearson and w. M. Reed, eds. Isolation and identification of avian pathogens 4^th ed. American Association of Avian Pathologists. p. 156-163. 

ARP, L. H. and J. K. SKEELES. 1991. Turkey bordetellosis (Coryza) In: B. W. Calnek, H. J. Barnes, W. M. Reid and H. W. Yoder Jr, eds. Diseases of Poultry, 9th ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa. p. 277-288.

RP, L. H. and N. F. CHEVILLE.1984. Tracheal lesions in young turkeys infected with Bordetella avium. Am J. Vet. Res. 45:2 196-2200.

BLACKALL, P. J. and C. M. DOHENY. 1987. Isolatiom and characterization of Bordetella avium and related species and an evaluation of their role in respiratory disease in poultry. Aust Vet. J. 64:235-239.

BLACKALL, P. J. and J. G. FARRAH.1985. Isolation of Bordetella aviun from poultry. Aust. Vet. J. 62: 370-372.

DOMINGO, D. T ., M. V. JACKWOOD and T. P. BROWN. 1992. Filamentous forms of Bordetella avium: culture conditions and pathogenicity. Avian Dis. 36:707-713.

FILION, P. R., S. CLOUTIER, E. R. VRANCKEN and G. BERNIER. 1967. Infection respiratoire du dindonneau causee par un microbe apparente au Bordetella bronchiseptica. Can. J. Comp. Med. Vet. Sci. 31:l29-134.

GRAY,J. G., J. F. ROBERTS, R. C. DILLMAN and D. G. SIMMONS. 1983. Pathogenesis of change in the upper respiratory tracts of turkeys experimental1y infected with an Alcaligenes faecalis isolate. Infect. Immun. 42;350-355.

GELB, J. and M. W. JACKWOOD. 1998. Infectious Bronchitis. Isolation and identification of avian pathogens 4^th ed. Swayne, D. E.; J. R. Glisson, M. W. Jackwood; J. E. Pearson and W. M. Reed, eds. American Association of Avian Pathologists. p. 169-174.

JACKWOOD, M. W., S. M. McCARTER and T. P. BROWN. 1995. Bordetella avium: an oportunistic pathogen in leghorn chickens. Avian Dis. 39:360-367.

JACKWOOD, M. W., Y. M. SAIF, P. D. MOORHEAD and R. N. DEARTH. 1985. Further characterization of the agent causing coriza in turkeys. Avian Dis. 29:690- 705.

KELL Y, B. J ., G. Y. GHAZIKHANIAN and B. MA YEDA. 1985. Clinical outbreak Bordetella avium infection in two turkey breder flocks. Avian Dis. 30:234-237.

KERSTERS, K., K. H. HINZ HERTLE, P. SEGERS, A. LIEVENS, O. SIEGMANN and J. De LEY. 1984. Bordetella avium sp. Nov. isolated from the respiratory tracts of turkeys and other birds. Int. J. Syst. Bacteriol. 34:56-70.

MONTGOMERY, R. D., S. H. KLEVEN and P. VILLEGAS.1983. Observations on the pathogenecity of Alcaligenes faecalis in chickens. Avian Dis. 27:751-761.

PARDUE, S. L. and G. H. LUGINBUHL. 1998. Improvement of poult performance following Bordetella avium challenge by administration of a novel oxy-halogen formulation. Avian Dis. 42:140-145.

SACCO, R. E., K. E. NESTOR and R. A. KUNKLE. 2000. Genetic variation in response of turkeys to experimental infection with Bordetella avium. Avian Dis.44:197-200.

SAIF, Y. M., P. D. MOORHEAD, R. N. DEARTH and D. J. Jackwood. 1980. Observations on Alcaligenes faecalis infection in turkeys. Avian Dis. 24:665-684.

SKEELES, J. K. and L. H. ARP. 1997. Bordetellosis (turkey coriza) In: Calnek B. W., Barnes H. J.; Beard C. W.; McDougald and J. M. Saif, eds. Diseases of Poultry, 10th ed. Iowa state University Prees, Ames, Iowa. p.275-287.

SKEELES, J. K. and M. W. JACKWOOD. 1998. Bordetellosis. In: Swayne, D. E.; J. R. Glisson, M. W Jackwood.; J. E. Pearson and W. M. Reed, eds. Isolation and identification of avian pathogens 4^th ed. American Association of Avian Pathologists. 26-28.

WILDING, G. P. (1996). Bordetella avium (Turkey coriza). In: F.T.W. Jordan and M. Pattison, eds. Poultry diseases. 4^th ed. London, England. W. B. Saunders Company. p. 57-59.