Veterinaria Trop. 26(1): 63- 76.2001  

^* Investigador y **Técnicos Asociados a la Investigación. INIA.
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias.
Apdo. 70. Las Delicias. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.

Recibido: julio 14, 2000.

 RESUMEN

Treinta y dos cepas de Salmonella sp. fueron aisladas de cerdos con diagnóstico clínico de enteritis, y fue analizada su susceptibilidad frente a 12 antimicrobianos de uso común en la práctica veterinaria en Venezuela. Los cerdos procedían de granjas porcinas del estado Aragua. E1100% de la cepas de Salmonella resultó resistente a estreptomicina; también se observó resistencia para tetraciclina y triple sulfa (96,87%). Los aislamientos fueron altamente resistentes a estos tres agentes antimicrobianos con valores de concentraciones mínimas inhibitorias mayores de 500mg/ml; esta resistencia no fue transferible. Se observaron 26 patrones de resistencia múltiple y los aislamientos fueron altamente susceptible a colimicina. El alto número de cepas con resistencia múltiple observado, revela la existencia de fuertes presiones selectivas ejercida por el uso indiscriminado de estos antimicrobianos en la población porcina analizada.

Palabras Clave: Salmonella sp.; enteritis; susceptibilidad antimicrobiana.

INTRODUCCIÓN

Las enteropatías constituyen una de las infecciones más comunes en las explotaciones porcinas, y son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, especialmente en países en vías de desarrollo. Entre los microorganismos responsables de este proceso figuran bacterias, virus y parásitos que no siempre tienen la misma participación, por lo que la infección puede ser debida a un solo agente o a una combinación de los mismos (Morín et al., 1983).

De los muchos agentes bacterianos de reconocida importancia como responsables de la enterocolitis porcina en Venezuela figura Salmonella sp. con una frecuencia de aislamiento de 13,3% en cerdos entre 6 y 9 semanas de edad, produciendo alta mortalidad (Pineda et al., 1992).

El género Salmonella es responsable de una de las zoonosis más importantes; la manifestación clínica en el hombre es de una gastroenteritis o toxi-infección alimentaria. En el cerdo se presenta fundamentalmente como una enterocolitis aguda o crónica, septicemia e infecciones focales (Jubb et al., 1985).

La incidencia de salmonelosis en cerdos está estrechamente vinculada con el sistema de explotación, en particular con los de tipo intensivo que han contribuido con la diseminación y mantenimiento de la infección, provocando el uso indiscriminado de diversos antimicrobianos para el control de este proceso infeccioso, como terapéuticos, agentes promotores de desarrollo y preventivos de enfermedades (Tzipori, 1981).

La selección del antimicrobiano como terapéutico se realiza generalmente sobre bases empíricas, sin tomar en cuenta las pruebas de susceptibilidad in vitro y aunque su efectividad no es estrictamente correlacionada in vivo constituye el instrumento más práctico y de mayor valor en una terapia antimicrobiana efectiva (Libal y Gates, 1982).

La eficacia de estos agentes terapéuticos está siendo ampliamente comprometida con el desarrollo de resistencia a los mismos por parte de los microorganismos infecciosos normalmente disponibles, debido al uso indiscriminado y arbitrario en la medicina humana y veterinaria, trayendo como consecuencia la violación del equilibrio existente entre bacterias y seres más evolucionados (Carmona y Guzmán, 1994).

La aparición de cada nuevo antimicrobiano va seguida de un progresivo desarrollo de resistencia del mismo en lapsos variables, ya que se promueve la dsaparición de cepas susceptibles y la propagación de cepas resistentes por presión selectiva (Espinasse, 1993; Marte y Courdet, 1993; Shah et al., 1993).

La resistencia a los antimicrobianos es común entre los géneros de enterobacterias y ha sido ampliamente señalada en cepas de Salmonella sp. de origen porcino, con una amplia complejidad en los patrones de resistencia (Bertschinger et al., 1996; Tsai y Sitjar, 1994; Shah et al., 1993).

Esta información sobre la resistencia es de suma importancia desde el punto de vista de salud pública, debido a que estas cepas bacterianas al llegar al hombre a través de la cadena alimentaria se constituyen en un reservorio de gran cantidad de genes de resistencia, que pueden ser transferidos a patógenos de importancia en medicina humana y veterinaria y más grave aún a la flora normal intestinal (Shah et al., 1993).

El propósito de este estudio es presentar los resultados de aislamientos de salmonelas de cerdos con infección entérica, y evaluar cualitativa y cuantitativamente su susceptibilidad antimicrobiana en las granjas muestreadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de las muestras. Se realizaron muestreos en 12 granjas porcinas donde las enteritis representa un problema de difícil control. Fueron seleccionadas muestras de heces e intestino de cerdos entre 6 y 10 semanas de edad, con signos clínicos de enfermedad entérica. Las muestras de heces fueron tomadas con hisopos y colocadas en medio de transporte de Amies. Todas las muestras se transportaron en refrigeración hasta el laboratorio.

Aislamiento e identificación de cepas bacterianas. El estudio bacteriológico se realizó por siembra directa de las muestras en medios de enrequicimiento de Rappaport Vassiliadis (RV) y caldo tetrationato (CT), y en los medios selectivos de agar Salmonella-Shigella (SS) y agar verde brillante (VE); se incubaron a 37 °C, excepto el CT que fue incubado a 42 °C. Luego de 18-24 horas el CT y RV fueron repicados a SS y VE (Koneman et al., 1979; Nietzeld et al., 1998). La identificación consistió en el estudio de los caracteres culturales y bioquímicos, fundamentalmente oxidasa, indol, movilidad, producción de hidrógeno sulfurado, hidrólisis de la urea, desaminación de la fenil alanina, descarboxilación de la lisina, utilización del malonato y citrato de sodio, rojo de metilo, Voges Proskauer y betagalactosidasa.

Susceptibilidad a los antimicrobianos. Las cepas aisladas fueron crecidas en caldo tripticasa soya (CTS) hasta alcanzar una concentración de 10⁸ bacterias. Posteriormente fueron sembradas en placas de agar Muller Hinton y se confrontaron a 12 diferentes antimicrobianos a determinadas concentraciones; las placas se incubaron a 37 °C por 18 h. Los resultados fueron expresados en términos de sensible o resistente según valores patrones para los diferentes antimicrobianos (Bauer et al., 1966).

La técnica de dilución en agar o determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) se realizó para cuantificar la resistencia para los antimicrobianos mayormente comprometidos.

En este trabajo un cultivo puro de cada cepa, a igual concentración celular, fue inoculado en placas dobles de agar Muller Hinton, al cual se adicionó el antimicrobiano correspondiente, a diferentes concentraciones expresadas en mg/ml. el inóculo fue colocado mediante el uso de un replicador múltiple y las placas se incubaron a 37 °C por 18-24 h. Posteriormente se determinó la CMI como la más baja concentración del agente antimicrobiano que es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

Transmisibilidad de los determinantes de resistencia. Se realizó una mezcla dc conjugación entre las cepas donantes (Ios aislados) y la cepa receptora (E. coli K12), la cual fue sembrada en placas de agar nutritivo incubada a 30 °C por 12 h. Posteriormente se resuspendió este inóculo y se realizaron diluciones seriadas con un factor 1/10; cada dilución se sembró en placas de agar selectivo con el antimicrobiano a seleccionar .

Igualmente se utilizaron los antomicrobianos que resultaron más comprometidos y se incubaron a 37 °C por 48 h a fin de detectar colonias transconjungantes (Pineda et al., 1998).

Análisis Estadísticos. Este se efectuó comparando los porcentajes de resistencia de las cepas en estudio mediante la prueba de Z, utilizando el programa Integrated Statistical Software (Salazar y Valle, 1993).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Mediante el estudio bacteriológico de las muestras analizadas se logró el aislamiento de 32 cepas de Salmonella sp. La caracterización de los aislamientos se confirmó considerando todas las características culturales y bioquímicas correspondientes. Estas cepas no fueron serotipificadas, sin embargo, estudios previos realizados por nosotros (Pineda et al., 1992), revelan que la mayoría de las cepas de Salmonella sp. aisladas de cerdos en el país son S. cholerae suis var. kunzendorf seguido por S. typhimurium.

El estudio de la susceptibilidad antimicrobiana, revela que las cepas de Salmonella sp. fueron resitentes (100%) a estreptomicina, seguido por tetraciclina y triple sulfa, con frecuencias de 96,87%, neomicina 78,12% trimetoprin sulfametoxazole 75,00%, kanamicina 68,75%. El 75% de los antimicrobianos probados mostraron frecuencias de resistencia por encima del 50%. La más baja frecuencia de resistencia fue para colimicina con 9,37% (Cuadro 1).

El estudio cuantitativo de esta resistencia se efectuó para los antimicrobianos más comprometidos (estreptomicina, tetraciclina y triple sulfa) mediante las CMI.

Para estreptomicina el 6,25% de las cepas presentó una resistencia intermedia, al oscilar entre valores mayores a 25 y 125/mg/ml; el resto de las cepas fueron altamente resistentes con valores de CMI mayores de 500/mg/ml (Cuadro 2).

 En cuanto a tetraciclina, 12,5% de las cepas presentó igualmente resistencia intermedia, con CMI entre 25 y 125/mg/ml; el resto fueron altamente resistentes con valores de CMI mayores 500/mg/ml (Cuadro 2).

Para triple sulfa la resistencia 6,25% fue intermedia, con CMI entre 25 y 125,mg/ml; el resto fueron altamente resistentes con valores CMI mayores de 500,mg/ml (Cuadro 2).

Todas las cepas presentaron resistencia múltiple, con resistencia al menos a 3 antimicrobianos (un aislamiento) y máximo a 12 (dos aislamientos). Se determinaron 26 patrones de resistencia múltiple diferentes siendo los más frecuentes los que mostraron ocho y nueve marcadores de resistencia, observándose como una constante la resistencia para estreptomicina. Los patrones se mantuvieron constantes en el lapso de tiempo del estudio (Cuadro 3). No se observó transmisibilidad por conjugación de las cepas evaluadas.

La eficacia de cada antimicrobiano se presenta en al Cuadro 4, la mayor actividad fue observada para colimicina (90,62%) seguido por gentamicina (68,75%).

 Al comparar resistencia y susceptibilidad, el estudio estadístico reveló que para la ampicilina, cefalotina y cloranfenicol no hubo diferencias significativas, contrario al resto de los antimicrobianos probados (P < 0,01), pero sí se observaron diferencias significativas entre la mayoría de los antimicrobianos y colimicina (P < 0,01).

Los resultados evidencian que en la enteritis está ampliamente involucrado el genero Salmonella, como agente causal, lo cual se corroboró con el análisis bacteriológico correspondiente; esta información coincide con otros reportes en cuanto a la vinculación de este agente etiológico con la enteritis en esta etapa de desarrollo porcino (Jubb et al., 1985; Pineda et al., 1992).

El tratamiento más frecuente utilizado para este tipo de infección es la terapia antimicrobiana. Sin embargo, su eficacia con el tiempo está siendo ampliamente comprometida con la aparición frecuente de aislamientos resistentes a los antimicrobianos normalmente disponibles (Carmona y Guzmán, 1994; Espinasse, 1993; Martel y Courdet, 1993).

Las frecuencias de resistencia para cada antimicrobiano fueron elevadas, si se considera que más del 75% de los antimicrobianos probados para Salmonella mostraron frecuencias por encima del 50%, similar a lo observado por otros autores (Shah et al., 1993; Wray et al., 1993).

Los mayores porcentajes de resistencia detectados oscilaron entre 100% y 96,87%, y fueron para estreptomicina, tetraciclina y triple sulfa, hallazgo que concuerda con lo expresado en otros estudios (Espinasse, 1993; Tsai y Sitjar, 1994; Wray et al., 1993).

Al analizar los valores de CMI para estos antimicrobianos, se aprecia que esta resistencia tiene un alto nivel en la mayoría de las cepas probadas, expresada en valores de 500 hasta 1,mg/ml, considerados muy altos, por lo que encajan en la denominación de cepas altamente resistentes. Esta condición podría resultar de su uso ampliamente difundido como aditivos en los alimentos de consumo para cerdos y de su abuso como terapéuticos. Por lo tanto, la circulación de aislamientos con este patrón de resistencia refuerza la necesidad de establecer un uso racional de estos antimicrobianos en el ambiente porcino en las granjas evaluadas.

Altas frecuencias de resistencia, aunque en menor proporción, fueron igualmente observadas para neocimina, trimetoprin- sulfametoxazole, trimetoprin, kanamicina sobre-pasando el 60%, similar a lo reseñado por otros investigadores (Tsay y Sitjar, 1994). Esta situación es relevante si consideramos que son utilizados continuamente como terapéuticos para combatir estos procesos infecciosos. Por lo tanto las implicaciones clínicas de este hecho son de suma importancia para la elección del antimicrobiano y la dosis adecuada en cada caso.

Las cefalosporinas habían constituido una alternativa para el tratamiento de este tipo de infecciones (Tsai y Sitjar, 1994). Sin embargo, en este trabajo se encontraron aislamientos con sensibilidad reducida a este droga, con frecuencias de resitencia de 50%, situación que debe servir de alerta para darle un uso más racional y efectuar a sustituirlas o a su rotación por cefalosporinas de 2^da ó 3^ra  generación.

En cuanto a las frecuencias de resistencias ( 40,60% ) obervadas para cloranfenicol, es importante señalar que es uno de los antimicrobianos considerados fuera de uso por sus graves implicaciones clínicas. Sin embargo, se emplea en Venezuela, a diferencia de otros paises como Estado Unidos donde su uso está restringido y el problema de cepas de Salmonella resistentes a este antimicrobiano ha disminuido notablemente (Espinasse, 1993).  

Toda esta información indica la poca probabilidad de éxito en la terapia de la salmonelosis porcina con estos antimicrobianos en las granjas estudiadas, donde el uso excesivo de antimicrobianos, generalmente sin prescripción médica, es frecuente.

Los resultados obtenidos en este investigación demuestran que la resistencia múltiple es más frecuente que la simple en estos aislados ya que el 100% exhibió resistencia múltiple, con resistencia al menos a 3 antimicrobianos y máximo a 12 y se observaron 26 patrones con resistencia constante estreptomicina (Cuadro 3).

No se detectó variación de los patrones en el tiempo; esta condición indica la ventaja selectiva que tienen cepas para mantenerse en estos ambientes, favorecida por el uso continuo de estos antimicrobianos. En razón de ello es importante el conocimiento de los patrones de resistencia por área greográfica a fin de determinar las pautas de la terapia antimicrobiana a seguir .

La determinación de la complejidad de los patrones de resistencia diagnosticados, similar a lo reportado por Ryder et al. (1980), tiene un gran valor desde el punto de vista de salud pública ya que S. tiphymurium es el segundo serotipo, en importacia, presente en cerdos del país (Pineda et al., 1992); el mismo posee la propiedad de adaptarse a cualquier huésped y es responsable de antoxicaciones alimentarias y salmonelosis sistémicas en el hombre.

La resistencia transmisible ha sido señalada para Salmonella sp. (Ryder et al., 1980), aunque en menor proporción que para otras enterobacterias. Sin embargo, en este trabajo no se observó esta situación, probablemente porque se requiere mayor número de cepas a evaluar y realizar la selección con otros antimicrobianos.

En cuanto a la alta susceptibilidad de colimicina, los resultados coinciden con lo señalado por otros autores, aunque han reportado igualmente un reducido número de cepas resistentes (Bertssschinger et al., 1996). Esta condición podría explicarse debido a que el control de la resistencia para colimicina es de origen cromosomal y por lo tanto menor si se compara con los antimicrobianos que poseen control plasmídico. Por lo tanto, este antimicrobiano podría constituir una alternativa para el control de este proceso infeccioso.

La experiencia indica que es posible reducir la resistencia a los antimicrobianos si se crean mecanismos de divulgación que influyan en los hábitos de prescripción de los mismos en la comunidad de criadores y veterinarios. Por esta razón las políticas en sanidad animal deben hacer hincapié en controlar su uso creando normativas que regulen su administración y enfatizar la necesidad de una medicina preventiva de calidad.

AGRADECIMIENTO

Los autores expresan su agradecimiento a FUNDACITE -Aragua por el apoyo financiero para la realización de este trabajo mediante el proyecto No. DLAG0072.

SUMMARY

Thirty two strains of Salmonella sp. were isolated from swine farms located in Aragua State. Animal were diagnosed with enteritis. Strains were analyzed in order to determined their susceptivity to 12 antimicrobial of common use in veterinary practices in Venezuela. One hundred percent of the strains were resistant to streptomycin, and a high frecuency of resistance was observed for tetracycline and triple sulfa (96,87%). Isolations were highly resistant to these 3 microbial agents with values of CMI from 500 ,mg/ml. This resistance was not transferable. Twenty s ix patterns of multiple resitance were observed and these isolations were highly susceptible to colimicine. The high frequency of multiple resistance observed reveals the existence of strong selective pressures caused by the indiscriminate use of these antimicrobials on the swine population studied. 

Key Words: Salmonella sp.; enteritis; antimicrobial susceptivity.

BIBLIOGRAFÍA

BAUER, A. W., W. M. KIRBY, J. C. SHERRIS and M. TRUCK. 1996. Antibiotic susceptibility testing by a single disk meethod. Am. J. Clin. pathol. 45:493-496.

BERTSCHINGER, H. V ., C. METTLER, C. BLASER and C. FRITZSCHE. 1996. Colistin resistance of E. coli isolated from pigs with oedema disease and postweaning diarrhoea detected by a modified agar dilution method IPVSC. 14th. p. 271.

CARMONA, O. y M. GUZMÁN.1994. Resistencia bacteriana a los antimicrobianos en Venezuela. Bol. Soc. Ven. Microb. 14(1):15-20.

ESPINASSE, J. 1993. Responsible use antimicrobials in Veterinary medicine: perpectives in France. Vet. Microb. 35:289-301.

JUBB, K. V. P., C. KENNEDY and N. C. PALMER. 1985. Pathology of domestic animals. 3ra. ed. New York. Academic Press. p. 120-127.

KONEMAN, E. W ., S. D. ALLE, V. R. DOWELL and H. M. SOMMERS. 1979. The enterobacteriacea. In: Diagnostic microbiology ed: J. B. Lippincott. Phy. USA. p. 55-110.

LIBAL, M. C. and C. E. GA TES. 1982. Antimicrobial resistance in Escherichia coli strains isolated from pigs with pigs with diarrhea. J. Am. Vet. Med. Ass. 180:8.

MARTEL, J. L. and M. COURDET.1993. Bacterial resistance monitoring in animals: The French national experiences of surveillance schemes. Vet. Microb.35:321-338.

MORÍN, M., D. TURGEON, J. JOLETTE, Y. ROBINSON, J. B. PHANEUF, M. SAUV AGEAN, E. BEAUREGARD, E. TEUSCHER, R. HIGGINS and S. LARIVIERE. 1983. Neonatal diarrhea of pigs in Quebec infections causes of significant outbreaks. Can. J. Comp. Med. 47: 11-17.

NIETFÉLD,J. C., B. KELL Y, S. S. DRITZ, U. PEDER andJ. GALLAND. 1998. Comparison of conventional and delaye secondary enrichment for isolated of  Salmonella sp. from swine samples. J. Vet. Diagn. Invest. 10(3):285-287.

PINEDA, Y. y V. RODRÍGUEZ-LEMOINE. 1988. Producción y trans- ferencia de fimbrias K88 toxina termoestable "a" y resistencia a los antimicrobianos en cepas de Escherichia coli aisladas de suinos con diarrea. Vet. Trop. 13:55-67.

PINEDA, Y., A. GALLARDO, J. POLANCO, A. CLAVIJO y F. MÉNDEZ.1992. Etiología bacterifina de la diarrea en cerdos de Venezuela. Vet. Trop. 17:41-52.

RYDER, R. W., P. A. BLAKE, A. C. MURLÍN, G. P. CARTER, R. A. POLLARD, M. A. MERSON, S. D. ALLEN and D. .J. BRENNER. 1980. Increase in antibiotic resistance among isolates of Salmonella sp. in the United States. 1967-1975. J. Infect. Dis. 142:485-491.

SALAZAR, R. and A. V ALLE. 1993. Integrated Statistical sofware.

SHAH, P. M., V. SCHAFER and H. KNOTHE. 1993. Medical and Veterinary use of antimicrobial agents: implications for public health. A clinician's view on antimicrobial resistance. Vet. Microb. 35:269-274.

TSAI, S. S. and M. SITJAR. 1994. Disc sensitivity of 1992-1993. Taiwan isolates of Salmonella cholera suis to ceftiofur sodium and lincospectin. IPVSC p. 184.

TZIPORI, S. 1981. The aetiology and diagnosis of calf diarrhoea. Vet. Rec. 108:510-514.

WRA Y, C., I. M. McLAREN and Y. E. BEEDELL. 1993. Bacterial resistance monitoring of Salmonellas isolates from animals, national experience of surveillance schemes in the United Kingdom. Vet. Microb. 35:313-319.