DETERMINACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL EN BOVINOS VACUNADOS CON LA CEPA RB51, UTILIZANDO LA TÉCNICA DE WESTERN-BLOT

Nelly Candelo de Arriojas*, Alí Benavides^†**, Luis Arriojas**, Carlos Huerta***,
 M. Marcano**** y G. Meléndez****

Se realizó un estudio para determinar el efecto serológico de la vacuna anti-Brucella cepa RB51, en 25 bovinos de 3 a 4 meses de edad. El desarrollo de la inmunidad humoral después de la vacunación fue evaluado por la prueba de Western-blot (WB), y pruebas convencionales (placa, tubo, 2mercaptoetanol, card test, fijación de complemento). Por la prueba de WB se detectó la presencia de anticuerpos en ell 00% de los animales, desde los 30 días hasta los 90 d postvacunación; 64% (11=16) a los 120 d, el 12% (n=3) a los 150 d, no detectándose anticuerpos a los 180 d. Por las pruebas: placa, tubo, 2 mercaptoetanol, card test y fijacíón de complemento, no hubo seroconversión en ninguno de los animales luego de aplicada la vacuna, demostrándose que la misma no produce seroconversión para el antígeno-O; sin embargo, desarrolla anticuerpos vacunales que no interfieren con el diagnóstico serológico de rutina.

Palabras Clave: Brucella; cepa; RB51; Western-blot.

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una enfermedad contagiosa que afecta tanto a los animales domésticos, como silvestres y al hombre, recientemente detectada en mamíferos marinos (Tryland et al., 1999). El agente causal de esta enfermedad es una bacteria del género Brucella y caracterizada por una variedad de signos clínicos, como aborto, infertilidad, artritis, osteomielitis y mortalidad en animales domésticos y silvestres (Enright, 1990).

La prevención de la infección y por lo tanto de la enfermedad en bovinos, puede lograrse mediante la aplicación de vacunas. Desde 1940 se viene usando la vacuna cepa 19 en el control de la brucelosis bovina, sin embargo, al realizar la serología por las pruebas serológicas convencionales (placa, tubo, 2 mercaptoetanol, card test, rivanol y fijación de complemento), no ha sido posible distinguir entre anticuerpos vacunales y los de infección, ya que éstas se basan en la detección de anticuerpos dirigidos contra la cadena-O (antígeno-polisacarido), formado por un homopolímero de perosamina, capaz de inducir respuesta de anticuerpos en los animales expuestos a cepas lisas Brucella debido a que es un antígeno inmunodominante ausente en cepas rugosas. La vacuna cepa 19 también posee el antígeno-O, por lo tanto tiende a seroconvertir en los bovinos vacunados, confundiendo así el diagnóstico de la enfermedad (Nicoletti, 1981).

Debido a los problemas de diagnóstico serológicos cuando se aplica la cepa 19, B. abortus se desarrolló la cepa RB51, derivada a partir de la B. abortus cepa 2308. Es una cepa altamente atenuada, rugosa y con delección del antígeno-O, características muy estables, comprobadas después de múltiples pasajes in vilro e in vivo a través de varias especies de animales (Schurig, 1999).

Al no poseer el antígeno-O, la vacunación a bovinos, no induce la producción de anticuerpos dirigidos a este antígeno, en consecuencia, bovinos vacunados con la cepa RB51 resultarán negativos a las pruebas serológicas convencionales (Olsen et al., 1997, Lord et al., 1998), permitiendo una fácil diferenciación de los animales infectados de los vacunados, proporcionando un mejor control de la enfermedad.

La prueba de Westem-blot (WB) es una técnica usada para detectar proteínas fijas a una matriz (Towbin et al., 1979), altamente sensible y detecta a partir de 10 picogramos de proteína (Gershoni y Palade, 1983). Ha sido utilizada para diferenciar la respuesta de vacunación con la cepa 19 B. abortus infectante (Belzer et al., 1998). En estudios serológicos en alces expuestos a la B. suis biovar 4 (Edmonds et al., 1999). Igualmente para la identificación taxonómica del género Brucella (Kulalovi et al., 1997), y para el estudio serológico en vacunas anti-Brucella de ADN (Sriranganathan et al., 2000). En el campo humano se utiliza para el diagnóstico de la toxoplasmosis congénita (Menard et al., 1998) y otras enfermedades.

El objetivo del trabajo fue evaluar la respuesta inmunológica humoral en animales vacunados con la cepa RB51, utilizando la técnica de WB y demostrar la no interferencia de estos anticuerpo s en el diagnóstico serológico.

Se seleccionaron 25 bovinos hembras, raza Holstein, de 3 y 4 meses de edad, a los cuales se les aplicó 2 ml de la vacuna RB51, lote No. 1253, en una sola dosis, vía intramuscular. Se tomaron muestras de sangre sin anticoagulante antes de la vacunación y luego cada mes postvacunación durante seis meses. Para el estudio serológico, los sueros fueron procesados por las pruebas de placa, tubo, card test, 2mercaptoetanol y fijación de complemento, usando antígeno de células completas de B. abortus cepa 1119-3, según procedimiento de Alton et al. (1975), técnicas que determinan anticuerpo s dirigidos contra el antígeno-O.

También se aplicó la técnica de WB, la cual detecta proteínas a muy bajos niveles de concentración (Harlow y Lane, 1988); para esta prueba los sueros fueron sometidos a una dilución 1 :50 en solución TBS, pH 7,2. La técnica fue realizada de acuerdo al procedimiento desarrollado por Schurig et al. (1991); la Brucella cepa RB51 se sembró en placas de Petri preparadas con Tripticasa soya agar; las mismas fueron incubadas por 72 h, para luego ser cosechadas en solución salina (0,8%) estéril, raspando toda la superficie de las placas con asas desechables y virtiendo el material recolectado en un frasco, que se llevó a baño María (60°C) por 40 min; seguidamente se centrifugó a 12 000 rpm por 4 mino El antígeno fue lavado con solución 10 mMTris, pH 8, centrifugado a 12 000 rpm por 4 mío, después diluido al 10% de transmitancia utilizando un espectrofotómetro a 525 nm. Se prepararon alícuotas de 1 ml en viales que fueron centrifugados a 12 000 rpm, con eliminación del sobrenadante, agregándo1e posteriormente 100 μl de 0,01 M- Tris-HC1 pH 8, para ser conservados a -20°C.

Para el momento del uso del mismo, se diluyó el antígeno agregándosele 100 μl de buffer Laemmli (Sigma®). La transferencia fue efectuada en un Mini- Transfer- Blott (Bio-Rad).

Buffers, solución y geles utilizados:

Buffer de resolución: 3M Tris-HC1 pH 8,8

Buffer concentrador: 0,5M Tris-HC1 pH 6,8

Buffer reservorio: 0,25M Tris + 1,92 mg glicina

Solución de persulfato de amonio al 1,5%

Buffer TBS, pH 7,4 - 7,6:60,57 g Tris + 0,9 g Na C1 en 11 de agua destilada.

Buffer de transferencia: 5ml SDS + 3,02 Tris + 14,41 glicina + 200 ml metanol. Se lleva a 11 de agua destilada.

Gel de resolución: acrilamida al 40% 4,68 ml + buffer resolución 1,9 ml + SDS al 10% (Sigma®) 0,15 ml + HPLC-agua 7,57 ml + persulfato de amonio al 1,5% 1,5 ml + TEMED (Sigma®) 15 μl.

Gel de concentración: acrilamida al 40% 0,94 ml + Buffer de concentración 2,5 ml + SDS 10% 0,1 ml + HPLC- agua 5,96 ml + persulfato de amonio 1,5% 0,5 ml + TEMED 10 μl.

Procedimiento

El gel de resolución al 12,5% fue colocado en el aparato de electroforesis con una unidad Bio-Rad-Mini-ProteanII, dejándose polimerizar por 30 min; luego se preparó el gel de concentración, y se dejó polimerizar por 30 min. Simultáneamente se diluyó el antígeno con buffer Laemmli 1:1, llevándose a baño María en ebullición durante 5 min, agregándose posteriormente 20 μl a las ranuras de la cámara, menos a la primera a la cual se agregó el marcador de peso molecular (Multimark Estándar, Novex®), 5 μl.

El buffer reservorio y los geles se colocaron en el aparato de electroforesis, aplicándosele una corriente de 25 mAmp por gel, hasta que la proteína (antígeno) corriera a la parte inferior del gel (45 min aprox).

Las membranas de nitrocelulosa y filtros (Blotting-pad) se sumergieron en buffer de transferencia por espacio de 20 min para su posterior uso.

En el aparato de transferencia se colocaron los geles extraídos de la cámara de electroforesis y sobre ellos los filtros (Bloting), para luego pasar una corriente de 70 mAmp por cada membrana durante 1 h aproximadamente.

Para la coloración de la membrana se utilizó solución de Ponceaus Stain, manteniéndose en agitación por 5 min y posteriormente lavada con agua destilada, hasta la aparición de bandas en la membrana; esto con el fin de asegurar que las proteínas se fijaron a la membrana. Se bloqueó con una solución de gelatina de pescado al 0,25%, por 2 h.

La membrana fue cortada verticalmente en tiras, guiándose por el peine utilizado. Cada tira se utilizó para enfrentarse a cada muestra de suero de bovino, dejándose por 6 h en agitación, y lavándose tres veces con buffer TBS-tween (0,1 % Tween 20). Luego se agregó el conjugado anti IgG bovino marcado con Peroxidasa (Cappel®), dilución 1:500, manteniéndose en agitación por 1 h Y lavándose tres veces con TBS-tween.

Para la preparación de la solución sustrato se utilizaron: 30 μg de 4-cloro-1-naptol (Sigma®) + 55 ml metanol + 45 ml TBS + 300 μl de agua oxigenada al 3%, éste se añadió a las membranas (tiras) observándose hasta la aparición de bandas, y lavándose enseguida con agua corriente. Como control positivo se utilizó suero hiperinmune de cabra (Goat 48), utilizando un conjugado anti IgG cabra marcado con peroxidasa, (Cappel®), diluido 1:500.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este trabajo se encontró que todas las muestras de suero en cada una de las seis sangrías realizadas, y procesadas por las pruebas serológicas de placa, tubo, 2mercaptoetanol, card test y fijación de complemento, resultaron negativas, indicando que la vacuna no produjo seroconversión dirigida al antígeno-O, datos que coinciden con otros reseñados en la literatura (Olsen et al., 1997; Lord et al., 1998; Elzer et al., 1998), utilizando la vacuna en bovinos y realizando el estudio serológico.

El uso de la vacuna cepa RB51 permite una fácil diferenciación de los animales infectados, ya que no induce interferencia serológica, al contrario de lo que ocurre cuando se vacuna con la epa 19. Esta ventaja elimina o separa animales infectados, facilitando el control y erradicación de la enfermedad.

Al utilizar la técnica de WB se demostró la presencia de anticuerpos en los 25 animales a los que se les aplicó la vacuna anti-Brucella cepa RB51, los cuales fueron producidos por el estímulo de la misma, al observarse bandas o líneas en la membrana, indicando positividad, estos resultados coinciden con los obtenidos por Mariño et al. (1999), cuando evaluaron coayos con la cepa RB51 y utilizando esta técnica.

La inmunidad humoral tiene efectos de opsonización lo cual ayuda a la muerte de las bacterias intracelulares, pero sigue siendo una débil inmunidad, la cual no es capaz de proteger a los bovinos de la infección (Nielsen, 1995). La inmunidad protectiva depende principalmente de la respuesta mediadas por células en la cual los macrófagos juegan un papel importante, su actividad aumenta por efecto de las linfoquininas originadas por los linfoncitos "T". Sin embargo, la presencia de anticuerpos y niveles de éstos están relacionados con la presencia de la bacteria en el organismo (Nicoletti, 1989).

La detección de anticuerpos anti-Brucella RB51 se observó en todos los animales desde el primer mes postvacunación hasta los 90 d en el 64% (16 animales) a los 120 d, el 12% (3 animales) a los 150 d, Y no se detectaron anticuerpos a los 180 d postvacunación.

La presencia de estos anticuerpos hasta los 150 d postvacunación, indica que la bacteria es eliminada del organismo animal, luego de la aplicación de la vacuna antes de los 6 meses, efecto que no sucede con la cepa 19, pues la presencia de estos es más tardía en el tiempo. La detección de anticuerpos está relacionada con la presencia de la bacteria en organismo, indicando que el antígeno vacunal de la cepa RB51 desaparece antes de los 6 mes del organismo.

La desaparición rápida de la B. abortus cepa RB51 en el organismo podría ser debido a que las cepas rugosas son atacadas más fácilmente por los macrófagos (Nielsen, 1995).

En conclusión, este estudio demuestra que la vacuna anti-Brucella cepa RB51 sí estimula la inmunidad humoral, sin embargo, estos anticuerpos producidos no interfieren con el diagnóstico serológico al utilizar las pruebas convencionales.

This study was made to determine the serological effect ofthe Brucella vaccine straiq RB51. Twenty five bovines of 3-4 months of age were involved. The development of humoral irnmunity after vaccination was detected by Western-blot (WB) technique and 5 conventional serological tests: rapid plate agglutination, standard tube agglutination, 2mercaptoethanol, card test and complement fixation. Use of WB technique indicated presence of antibodies in 100% of animal s, from 30 days until 90 days post vaccination, 64% (n=16) at 120 days, 12% (n=3) at 150 days, and all animals were negative to antibodies, at 180 days post vaccination. With the five serological tests, all animals were negative after to vaccination until six month of age, demostrating that the vaccine did not produce antibodies against Ag-O, but developed antibodies that no interfere with routine serological diagnosis.

Key Words: Brucella; vaccine; RB51; Western-blot.

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