DETERMINACI�N DE LA INMUNIDAD HUMORAL EN BOVINOS VACUNADOS CON LA CEPA RB51, UTILIZANDO LA T�CNICA DE WESTERN-BLOT

Nelly Candelo de Arriojas*, Al� Benavides^�**, Luis Arriojas**, Carlos Huerta***,
 M. Marcano**** y G. Mel�ndez****

Se realiz� un estudio para determinar el efecto serol�gico de la vacuna anti-Brucella cepa RB51, en 25 bovinos de 3 a 4 meses de edad. El desarrollo de la inmunidad humoral despu�s de la vacunaci�n fue evaluado por la prueba de Western-blot (WB), y pruebas convencionales (placa, tubo, 2mercaptoetanol, card test, fijaci�n de complemento). Por la prueba de WB se detect� la presencia de anticuerpos en ell 00% de los animales, desde los 30 d�as hasta los 90 d postvacunaci�n; 64% (11=16) a los 120 d, el 12% (n=3) a los 150 d, no detect�ndose anticuerpos a los 180 d. Por las pruebas: placa, tubo, 2 mercaptoetanol, card test y fijac��n de complemento, no hubo seroconversi�n en ninguno de los animales luego de aplicada la vacuna, demostr�ndose que la misma no produce seroconversi�n para el ant�geno-O; sin embargo, desarrolla anticuerpos vacunales que no interfieren con el diagn�stico serol�gico de rutina.

Palabras Clave: Brucella; cepa; RB51; Western-blot.

INTRODUCCI�N

La brucelosis es una enfermedad contagiosa que afecta tanto a los animales dom�sticos, como silvestres y al hombre, recientemente detectada en mam�feros marinos (Tryland et al., 1999). El agente causal de esta enfermedad es una bacteria del g�nero Brucella y caracterizada por una variedad de signos cl�nicos, como aborto, infertilidad, artritis, osteomielitis y mortalidad en animales dom�sticos y silvestres (Enright, 1990).

La prevenci�n de la infecci�n y por lo tanto de la enfermedad en bovinos, puede lograrse mediante la aplicaci�n de vacunas. Desde 1940 se viene usando la vacuna cepa 19 en el control de la brucelosis bovina, sin embargo, al realizar la serolog�a por las pruebas serol�gicas convencionales (placa, tubo, 2 mercaptoetanol, card test, rivanol y fijaci�n de complemento), no ha sido posible distinguir entre anticuerpos vacunales y los de infecci�n, ya que �stas se basan en la detecci�n de anticuerpos dirigidos contra la cadena-O (ant�geno-polisacarido), formado por un homopol�mero de perosamina, capaz de inducir respuesta de anticuerpos en los animales expuestos a cepas lisas Brucella debido a que es un ant�geno inmunodominante ausente en cepas rugosas. La vacuna cepa 19 tambi�n posee el ant�geno-O, por lo tanto tiende a seroconvertir en los bovinos vacunados, confundiendo as� el diagn�stico de la enfermedad (Nicoletti, 1981).

Debido a los problemas de diagn�stico serol�gicos cuando se aplica la cepa 19, B. abortus se desarroll� la cepa RB51, derivada a partir de la B. abortus cepa 2308. Es una cepa altamente atenuada, rugosa y con delecci�n del ant�geno-O, caracter�sticas muy estables, comprobadas despu�s de m�ltiples pasajes in vilro e in vivo a trav�s de varias especies de animales (Schurig, 1999).

Al no poseer el ant�geno-O, la vacunaci�n a bovinos, no induce la producci�n de anticuerpos dirigidos a este ant�geno, en consecuencia, bovinos vacunados con la cepa RB51 resultar�n negativos a las pruebas serol�gicas convencionales (Olsen et al., 1997, Lord et al., 1998), permitiendo una f�cil diferenciaci�n de los animales infectados de los vacunados, proporcionando un mejor control de la enfermedad.

La prueba de Westem-blot (WB) es una t�cnica usada para detectar prote�nas fijas a una matriz (Towbin et al., 1979), altamente sensible y detecta a partir de 10 picogramos de prote�na (Gershoni y Palade, 1983). Ha sido utilizada para diferenciar la respuesta de vacunaci�n con la cepa 19 B. abortus infectante (Belzer et al., 1998). En estudios serol�gicos en alces expuestos a la B. suis biovar 4 (Edmonds et al., 1999). Igualmente para la identificaci�n taxon�mica del g�nero Brucella (Kulalovi et al., 1997), y para el estudio serol�gico en vacunas anti-Brucella de ADN (Sriranganathan et al., 2000). En el campo humano se utiliza para el diagn�stico de la toxoplasmosis cong�nita (Menard et al., 1998) y otras enfermedades.

El objetivo del trabajo fue evaluar la respuesta inmunol�gica humoral en animales vacunados con la cepa RB51, utilizando la t�cnica de WB y demostrar la no interferencia de estos anticuerpo s en el diagn�stico serol�gico.

Se seleccionaron 25 bovinos hembras, raza Holstein, de 3 y 4 meses de edad, a los cuales se les aplic� 2 ml de la vacuna RB51, lote No. 1253, en una sola dosis, v�a intramuscular. Se tomaron muestras de sangre sin anticoagulante antes de la vacunaci�n y luego cada mes postvacunaci�n durante seis meses. Para el estudio serol�gico, los sueros fueron procesados por las pruebas de placa, tubo, card test, 2mercaptoetanol y fijaci�n de complemento, usando ant�geno de c�lulas completas de B. abortus cepa 1119-3, seg�n procedimiento de Alton et al. (1975), t�cnicas que determinan anticuerpo s dirigidos contra el ant�geno-O.

Tambi�n se aplic� la t�cnica de WB, la cual detecta prote�nas a muy bajos niveles de concentraci�n (Harlow y Lane, 1988); para esta prueba los sueros fueron sometidos a una diluci�n 1 :50 en soluci�n TBS, pH 7,2. La t�cnica fue realizada de acuerdo al procedimiento desarrollado por Schurig et al. (1991); la Brucella cepa RB51 se sembr� en placas de Petri preparadas con Tripticasa soya agar; las mismas fueron incubadas por 72 h, para luego ser cosechadas en soluci�n salina (0,8%) est�ril, raspando toda la superficie de las placas con asas desechables y virtiendo el material recolectado en un frasco, que se llev� a ba�o Mar�a (60�C) por 40 min; seguidamente se centrifug� a 12 000 rpm por 4 mino El ant�geno fue lavado con soluci�n 10 mMTris, pH 8, centrifugado a 12 000 rpm por 4 m�o, despu�s diluido al 10% de transmitancia utilizando un espectrofot�metro a 525 nm. Se prepararon al�cuotas de 1 ml en viales que fueron centrifugados a 12 000 rpm, con eliminaci�n del sobrenadante, agreg�ndo1e posteriormente 100 μl de 0,01 M- Tris-HC1 pH 8, para ser conservados a -20�C.

Para el momento del uso del mismo, se diluy� el ant�geno agreg�ndosele 100 μl de buffer Laemmli (Sigma�). La transferencia fue efectuada en un Mini- Transfer- Blott (Bio-Rad).

Buffers, soluci�n y geles utilizados:

Buffer de resoluci�n: 3M Tris-HC1 pH 8,8

Buffer concentrador: 0,5M Tris-HC1 pH 6,8

Buffer reservorio: 0,25M Tris + 1,92 mg glicina

Soluci�n de persulfato de amonio al 1,5%

Buffer TBS, pH 7,4 - 7,6:60,57 g Tris + 0,9 g Na C1 en 11 de agua destilada.

Buffer de transferencia: 5ml SDS + 3,02 Tris + 14,41 glicina + 200 ml metanol. Se lleva a 11 de agua destilada.

Gel de resoluci�n: acrilamida al 40% 4,68 ml + buffer resoluci�n 1,9 ml + SDS al 10% (Sigma�) 0,15 ml + HPLC-agua 7,57 ml + persulfato de amonio al 1,5% 1,5 ml + TEMED (Sigma�) 15 μl.

Gel de concentraci�n: acrilamida al 40% 0,94 ml + Buffer de concentraci�n 2,5 ml + SDS 10% 0,1 ml + HPLC- agua 5,96 ml + persulfato de amonio 1,5% 0,5 ml + TEMED 10 μl.

Procedimiento

El gel de resoluci�n al 12,5% fue colocado en el aparato de electroforesis con una unidad Bio-Rad-Mini-ProteanII, dej�ndose polimerizar por 30 min; luego se prepar� el gel de concentraci�n, y se dej� polimerizar por 30 min. Simult�neamente se diluy� el ant�geno con buffer Laemmli 1:1, llev�ndose a ba�o Mar�a en ebullici�n durante 5 min, agreg�ndose posteriormente 20 μl a las ranuras de la c�mara, menos a la primera a la cual se agreg� el marcador de peso molecular (Multimark Est�ndar, Novex�), 5 μl.

El buffer reservorio y los geles se colocaron en el aparato de electroforesis, aplic�ndosele una corriente de 25 mAmp por gel, hasta que la prote�na (ant�geno) corriera a la parte inferior del gel (45 min aprox).

Las membranas de nitrocelulosa y filtros (Blotting-pad) se sumergieron en buffer de transferencia por espacio de 20 min para su posterior uso.

En el aparato de transferencia se colocaron los geles extra�dos de la c�mara de electroforesis y sobre ellos los filtros (Bloting), para luego pasar una corriente de 70 mAmp por cada membrana durante 1 h aproximadamente.

Para la coloraci�n de la membrana se utiliz� soluci�n de Ponceaus Stain, manteni�ndose en agitaci�n por 5 min y posteriormente lavada con agua destilada, hasta la aparici�n de bandas en la membrana; esto con el fin de asegurar que las prote�nas se fijaron a la membrana. Se bloque� con una soluci�n de gelatina de pescado al 0,25%, por 2 h.

La membrana fue cortada verticalmente en tiras, gui�ndose por el peine utilizado. Cada tira se utiliz� para enfrentarse a cada muestra de suero de bovino, dej�ndose por 6 h en agitaci�n, y lav�ndose tres veces con buffer TBS-tween (0,1 % Tween 20). Luego se agreg� el conjugado anti IgG bovino marcado con Peroxidasa (Cappel�), diluci�n 1:500, manteni�ndose en agitaci�n por 1 h Y lav�ndose tres veces con TBS-tween.

Para la preparaci�n de la soluci�n sustrato se utilizaron: 30 μg de 4-cloro-1-naptol (Sigma�) + 55 ml metanol + 45 ml TBS + 300 μl de agua oxigenada al 3%, �ste se a�adi� a las membranas (tiras) observ�ndose hasta la aparici�n de bandas, y lav�ndose enseguida con agua corriente. Como control positivo se utiliz� suero hiperinmune de cabra (Goat 48), utilizando un conjugado anti IgG cabra marcado con peroxidasa, (Cappel�), diluido 1:500.

RESULTADOS Y DISCUSI�N

En este trabajo se encontr� que todas las muestras de suero en cada una de las seis sangr�as realizadas, y procesadas por las pruebas serol�gicas de placa, tubo, 2mercaptoetanol, card test y fijaci�n de complemento, resultaron negativas, indicando que la vacuna no produjo seroconversi�n dirigida al ant�geno-O, datos que coinciden con otros rese�ados en la literatura (Olsen et al., 1997; Lord et al., 1998; Elzer et al., 1998), utilizando la vacuna en bovinos y realizando el estudio serol�gico.

El uso de la vacuna cepa RB51 permite una f�cil diferenciaci�n de los animales infectados, ya que no induce interferencia serol�gica, al contrario de lo que ocurre cuando se vacuna con la epa 19. Esta ventaja elimina o separa animales infectados, facilitando el control y erradicaci�n de la enfermedad.

Al utilizar la t�cnica de WB se demostr� la presencia de anticuerpos en los 25 animales a los que se les aplic� la vacuna anti-Brucella cepa RB51, los cuales fueron producidos por el est�mulo de la misma, al observarse bandas o l�neas en la membrana, indicando positividad, estos resultados coinciden con los obtenidos por Mari�o et al. (1999), cuando evaluaron coayos con la cepa RB51 y utilizando esta t�cnica.

La inmunidad humoral tiene efectos de opsonizaci�n lo cual ayuda a la muerte de las bacterias intracelulares, pero sigue siendo una d�bil inmunidad, la cual no es capaz de proteger a los bovinos de la infecci�n (Nielsen, 1995). La inmunidad protectiva depende principalmente de la respuesta mediadas por c�lulas en la cual los macr�fagos juegan un papel importante, su actividad aumenta por efecto de las linfoquininas originadas por los linfoncitos "T". Sin embargo, la presencia de anticuerpos y niveles de �stos est�n relacionados con la presencia de la bacteria en el organismo (Nicoletti, 1989).

La detecci�n de anticuerpos anti-Brucella RB51 se observ� en todos los animales desde el primer mes postvacunaci�n hasta los 90 d en el 64% (16 animales) a los 120 d, el 12% (3 animales) a los 150 d, Y no se detectaron anticuerpos a los 180 d postvacunaci�n.

La presencia de estos anticuerpos hasta los 150 d postvacunaci�n, indica que la bacteria es eliminada del organismo animal, luego de la aplicaci�n de la vacuna antes de los 6 meses, efecto que no sucede con la cepa 19, pues la presencia de estos es m�s tard�a en el tiempo. La detecci�n de anticuerpos est� relacionada con la presencia de la bacteria en organismo, indicando que el ant�geno vacunal de la cepa RB51 desaparece antes de los 6 mes del organismo.

La desaparici�n r�pida de la B. abortus cepa RB51 en el organismo podr�a ser debido a que las cepas rugosas son atacadas m�s f�cilmente por los macr�fagos (Nielsen, 1995).

En conclusi�n, este estudio demuestra que la vacuna anti-Brucella cepa RB51 s� estimula la inmunidad humoral, sin embargo, estos anticuerpos producidos no interfieren con el diagn�stico serol�gico al utilizar las pruebas convencionales.

This study was made to determine the serological effect ofthe Brucella vaccine straiq RB51. Twenty five bovines of 3-4 months of age were involved. The development of humoral irnmunity after vaccination was detected by Western-blot (WB) technique and 5 conventional serological tests: rapid plate agglutination, standard tube agglutination, 2mercaptoethanol, card test and complement fixation. Use of WB technique indicated presence of antibodies in 100% of animal s, from 30 days until 90 days post vaccination, 64% (n=16) at 120 days, 12% (n=3) at 150 days, and all animals were negative to antibodies, at 180 days post vaccination. With the five serological tests, all animals were negative after to vaccination until six month of age, demostrating that the vaccine did not produce antibodies against Ag-O, but developed antibodies that no interfere with routine serological diagnosis.

Key Words: Brucella; vaccine; RB51; Western-blot.

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