MÉTODO ISOPÉNICO MODIFICADO PARA LA PURIFICACIÓN DE TRIPANOSOMAS

Emir Espinoza*, Gisela Primera**, Nersa González*** y Walter Mosca****

El estudio tuvo como objetivo adaptar el método de purificación de protozoarios por intermedio de gradientes discontinuos de Percoll para obtener material antigénico puro de Trypanosoma vivax y Trypanosoma evansi, para utilizarlo en la detección de anticuerpos específicos por la técnica de Elisa. Los resultados obtenidos indican su uso potencial en los estudios epidemiológicos y de diagnóstico serológico de los tripanosomas patógenos de la ganadería rumiante y equina en Venezuela.

Palabras Clave: Método de concentración; Trypanosoma vivax; Trypanosoma evansi; detección de anticuerpos; rumiantes; equinos; Elisa.

INTRODUCCIÓN

Una de las limitaciones impuestas en la aplicación de las pruebas serológicas para el diagnóstico de la tripanosomiasis animal en Venezuela, es la dificultad de obtener antígenos puros que permitan la identificación específica y sin equivocación del agente causal (Espinoza et al., 1999). Con la aplicación de las técnicas serológicas en el país (Inmunofluorescencia indirecta, Elisa indirecta de anticuerpo), se han presentado inconvenientes para diferenciar la especie de tripanosoma infectante de los animales (González et al., 1999).

En la búsqueda de solucionar los inconvenientes en la purificación de material antigénico tripanosómico, son usados varios métodos, entre los cuales se citan, la hemaglutinación y centrifugación diferencial, centrifugación en gradiente de sacarosa, cromatografía de intercambio iónico (Grab y Bwayo, 1982, Ijagbone et al., 1989) partiendo de que los métodos de concentración pueden ayudar a mejorar el diagnóstico microscópico, no sólo por la concentración del mismo, sino también por la limpieza de cualquier material biológico contaminante (Medina et al., 1997). Por lo tanto, en este trabajo se adaptó el método de aislamiento isopénico de tripanosomas, tripomastigotes y amastigotes, descritos por Grab y Bwayo (1982) Y Mosca (1994), utilizando gradientes de diferentes densidades de Percoll.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sangre de animales infectados con las cepas de tripanosomas (T. vivax, IIV caprino; T. evansi, TeV1 rata Sprague Dawley) fue recolectada, usando como anticoagulante heparina sódica. Los gradientes discontinuos de Percoll se prepararon como solución de trabajo (ST), a partir de 100 ml de Percoll (Sigma®), mezclada con 8,55 g de sacarosa y 2 g de glucosa, ajustando el pH a 7,2. Los diferentes gradientes a las densidades deseadas se construyeron diluyendo la solución de trabajo con el medio RPMI®, y un añadido de antibiótico (gentamicina®al 0,2%), estableciéndose que las densidades requeridas para la purificación de T. vivax y T. evansi se ubicaron en 1,045 (1 ml ST; 1,73 ml RPMI), 1,050 (1 ml ST; 1,46 ml RPMI), 1,056 (1 ml ST; 1,20 RPMI), 1,060 (1 ml ST; 1,05 ml RPMI), 1,066 (1 ml ST; 0,86 RPMI) y 1,070 (1 ml ST; 0,76 ml RPMI).

Posteriormente, los gradientes se colocaron en tubos Falcón estériles, de 15 mi, de mayor a menor; añadiéndose les lentamente 2 ml de sangre infectada con tripanosomas. Seguidamente, los tubos fueron centrifugados a -5°C en una centrifuga refrigerada (Damon/CR45000) a 500 r.p.m durante 5 min y posteriormente a 1 600 r.p.m durante 30 min. Bajo estas condiciones, los eritrocitos y células blancas sedimentaron hasta el fondo del tubo. Las plaquetas quedaron suspendidas entre las capas 1,056 y 1,060 g/ml, y los parásitos sedimentaron entre la 1,056 y 1,060 g/ml.

Todas las bandas se separaron cuidadosamente, colectándose individualmente en tubos de ensayos estériles. Muestras de cada banda fueron analizadas por microscopía óptica. Las bandas que contenían los tripanosomas se lavaron tres veces con el medio RPMI en una centrifuga clínica convencional (2 500 r.p.m) para eliminar cualquier resto de Percoll. El taco o "pellet" obtenido se resuspendió en el mismo medio. Luego se procedió a su contaje a través de un hemocitómetro. La resuspensión se centrifugó nuevamente, congelándose en nitrógeno líquido a - 196°C.

Para su uso en la técnica de Elisa, el material criopreservado se resuspendió en dos volúmenes RPMI homogenizados para someterse a sonicación. Seguidamente, el materiallisado (tripanosomas), fue centrifugado a 7 000 r.p.m (microcentrifuga Fisher 159) por 15 min. El sedimento constituido por restos celulares se descartó, conservando el sobrenadante como extracto antigénico para ser aplicado en la técnica de Elisa.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los porcentajes de recuperación de los parásitos por intermedio de la purificación en Percoll, osciló entre 70 y 93% para las especies de T. vivax y T. evansi, respectivamente. De tal manera, interpretando los índices de recuperación de los hemoflagelados se puede inferir que los tripanosomas no fueron afectados grandemente por las altas fuerza de gravedad involucradas durante la separación en los diferentes gradientes. Las anteriores apreciaciones coincidieron con los resultados señalados por Grab y Bwayo (1982), quienes encontraron recuperaciones de parásitos viables, en el orden de 90%, principalmente de T. vivax adaptado a roedores.

Aunque la purificación de tripanosomas u otros protozoarios patógenos de los animales domésticos no es nuevo, el método descrito aquí abre nuevas potencialidades de estudios en el campo de la epidemiología y en el diagnóstico serológico de la tripanosomiasis animal en Venezuela, al permitir el uso de sistemas homólogo s para la identificación del agente causal específico (Ijagbone et al., 1989; Desquesnes y Tresse, 1996; Desquesnes et al., 2001).

SUMMARY

The objective ofthis work was to adapt the protozoa purification method, using discontinous gradients ofPercoll to obtain pure antigenic material of Trypanosoma vivax and T. evansi with purpose of using them to detect specific antibodies by the Elisa method. Results indicated method's potential use in epidemiological research and serological diagnostics of trypanosome in Venezuela cattle an equine livestock.

Key Words: Concentration method; Trypanosoma vivax; Trypanosoma evansi; hemoflagelate; ruminant; equine; Elisa.

BIBLIOGRAFÍA

ESPINOZA, E., N. GONZÁLEZ, T. PERRONE, P. ASO, L. HIDALGO Y L. BARAZARTE. 1999. Aplicación del ensayo inmunoenzimático (ELISA-Ac/T. evansi) para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma vivax en el estado Bolívar. Veterinaria Trop. 24(1):47-53.

DEQUESNES, M., Z. BENGALY, L. MILLOGO, y. MEME and H. SAKANDE. 2001. The analysis of the cross reactions occurring in antibody Elisa for the detection of trypanosomes can improve identification ofthe parasite species involved. Anol. Trop. Med. Parasitol. 95(2):141-155.

DESQUESNES, M. and L. TRESSE. 1996. Utilization of Trypanosoma evansi antigens in indirect Elisa for diagnosis of Trypanosoma sp. in livestok. In: Proceedings of First Symposium on New World Trypanosomes. Georgetown. Guyana. 105-110.

GONZÁLEZ, N., E. ESPINOZA, y E. SANDOVAL. 1999. Evaluación de la técnica de inmunofluorescencia indirecta mediante el uso de antígenos de Trypanosoma vivax y Trypanosoma evansi. Veterinaria Trop. 24(2): 131-136.

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IJAGBONE, l., C. STAAK and R. REINHARD. 1989. Fractionation of Trypanosome antigens for species specific serodiagnosis. Vet. Parasitol. 32:293-299.

MEDINA, C., H. GARCÍA and M. SALINAS. 1997. Use of discontinuous Percoll gradients to isolate Cyclospora oocysts. Anol. Trop. Med. Parasitol. 91(3):319-321.