Mariela Brett*, Carmen de Noguera*, Carlos Quiroz*, Morela de Rolo*, 
Antonio Herrera**  y Judith Martínez**

*Investigadores y **Técnicos Asociados a la Investigación.
INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP).
Sanidad Animal. Apdo. 70, Maracay 2102, estado Aragua. Venezuela.

Recibido: mayo 17,2004.

Se realizó un estudio para aislar e identificar cepas del virus de bronquitis infecciosa aviar (BIA) en pollos de engorde en la región central de Venezuela. Se muestrearon 21 granjas en los estados Aragua, Carabobo, Miranda y Cojedes: En 57,1 % de las granjas, las aves se vacunaron contra la enfermedad, utilizando la cepa M-120 al primer día de edad. Todas las aves estudiadas mostraron enfermedad clínica respiratoria, pero sólo tres casos (06, 6228, 6328), evidenciaron también enfermedad renal. En el estudio histopatológico las aves correspondiente a estos casos presentaron lesiones severas en riñones y lesiones menos consistentes en tracto respiratorio. En 57% de los 21 casos analizados, se aisló el virus de BIA, mediante la técnica en huevos embrionados libres de anticuerpos específicos. La caracterización genómica se realizó mediante la prueba de Transcriptasa Reversa-Reacción en cadena de la Polimerasa- y el análisis del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RT-PCR-RFLP, siglas en inglés). Las cepas 6228 y 6328 correspondieron al nuevo serotipo (Variante genotípica), y la cepa 06 correspondió al serotipo Massachussets.

Palabras Clave: Bronquitis; coronavirus; nefropatógena; serotipo; rt-pcr-rflp.

La bronquitis infecciosa aviar (BIA) es una enfermedad viral altamente contagiosa, producida por un miembro de la familia Coronaviridae, perteneciente al género Coronavirus. El genoma es un ARN de cadena simple en sentido positivo y en su superficie contiene proyecciones formadas por la glucoproteína de espiga grande (S), dividida post-traduccional en dos subunidades: S1 y S2 (Cavanagh et al., 1992; Kwon y Jackwood, 1995; Sapats et al., 1996; Shi et al., 2000; Kingham et al., 2000; Lee et al., 2001).

El virus afecta el sistema respiratorio y urogenital en pollos, ponedoras y reproductora,s (Criñion et al., 1970; Kinde et al., 1991; Wang et al., 1996; Di Fabio et al., 2000). La BIA se considera una de las principales enfermedades virales que causa pérdidas económicas significativas a la industria avícola mundial, debido a la baja ganancia de peso, disminución de la postura, baja fertilidad y decomisos en plantas procesadoras (Criñion et al., 1970; Gelb et al., 1991; Cavanagh y Naqi, 1997). La enfermedad tiene una morbilidad alta, 100% en la mayoría de los casos; pero la mortalidad frecuentemente es baja (5%), ésta aumenta cuando actúan cepas nefropatógenas (Fulton et al., 1993; Wang et al., 1996; Ziegler et al., 2002; Zanella et al., 2003) o cuando se presenta complicada con otros agentes patógenos como Escherichia coli, micoplasmas y otros virus (Goryo et al., 1984; Avellaneda et al., 1994; Naqi et al., 2001).

La enfermedad renal se observó por primera vez en 1960 (Cavanagh y Naqi, 1997), aislándose cepas nefropatógenas en todo el mundo. Estas cepas varían en patogenicidad, por ejemplo, en Australia la cepa T es altamente patógena y virulenta (Fulton et al., 1993); en Italia Zanella et al., (2003) mencionan cepas relacionadas con un serotipo (AZ 23/74), causando daños moderados y severos particularmente en pollos de engorde; sin embargo, las cepas Holte y Gray han sido reconocidas en EE.UU. con una patogenicidad baja (Mcdonald y McMartin, 1976); aunque recientemente estudios realizados por Ziegler et al., (2002) demostraron la presencia en Pensilvania de dos genotipos únicos del virus (PA/Wolgemuth/98 y PA/171/99), causantes de lesiones severas en pollos de engorde, ponedoras y reproductoras de todas las edades.

A pesar del uso regular de vacunas con virus atenuados e inactivados para controlar la enfermedad, ésta continúa afectando planteles avícolas, debido a que algunos serotipos no proporcionan inmunidad cruzada adecuada contra serotipos no relacionados ni contra cepas variantes, incluso contra serotipos relacionados (Erbeck y McMurray, 1998).

El efecto de la enfermedad renal depende de la virulencia de la cepa, la edad, estado inmune del ave y el manejo de la granja. Esta condición puede ser exacerbada por varios. factores relacionados con el estrés por frío, dietas altas en proteína animal o calcio Curnming (1969), o cuando la BIA está asociada con enfermedades inmunodepresoras como enfermedad infecciosa de la bursa (Goryo et al., 1984; Ziegler et al., 2002).

Se ha observado que el virus podría modificar su tropismo, dependiendo de la ruta de penetración al huésped (Uenaka et al., 1998; Ziegler et al., 2002; Zanella et al., 2003), por lo que el serotipo Massachussets (Mass), en la mayoría de los brotes, produce enfermedad respiratoria; aunque algunas cepas como la Mass-Holland, perteneciente al mismo serotipo, es nefropatógena (MacDonald y MacMartin, 1976). Otras investigaciones, basadas en biología molecular, sugieren que cambios en la secuencia de aminoácidos del genoma del virus, podría afectar el tropismo del mismo (Kwon y Jackwood, 1995; Sapats et al., 1996).

El tropismo por el tejido renal se ha observado en serotipos desconocidos y cepas variantes generalmente (El-Houadfi et al., 1986; Wang et al., 1996; Sapats et al., 1996; Ziegler et al., 2002; Zanella et al., 2003).

El virus de BIA es uno de los genéticamente más inestables, durante su replicación se producen seis ARN mensajeros por un mecanismo de transcripción discontinua (virus anidado), pudiendo ocurrir nuevas recombinaciones (Cavanagh y Naqi, 1997). Esto sugiere que la población de virus de BIA está en un estado de cambio continuo en su genoma, específicamente en la región hipervariable del gen que codifica la porción S 1 de la proteína de espiga (S), y son los que dan lugar a nuevos serotipos (Cavanagh et al., 1992; Jackwood y Jackwood, 1998; Shi et al., 2000; Kingham et al., 2000; Lee et al., 2001). Esto podría ser consecuencia de: presión inmunológica por el amplio uso de vacunas, infecciones mixtas (varios serotipos) o disminución del serotipo dominante (Lee et al., 2001; Zanella et al., 2003).

Las variaciones genéticas y antigénicas son observadas en todo el mundo (Nix et al., 2000; Di Fabio et al., 2000; Shi et al., 2000; Lee et al., 2001; lia et al., 2002). En Venezuela estudios realizados por Brett et al., (2001) aislaron el virus de BIA perteneciente a un genotipo no conocido (variante genotípica), cuyo patrón de la técnica de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP, siglas en inglés), no correspondió con el serotipo Mass, ni con otro serotipo conocido.

El objetivo de este estudio fue aislar e identificar cepas nefropatógenas del virus de BIA en planteles avícolas, específicamente de pollos de engorde, ubicadas en la región central de Venezuela.

Muestra. Se seleccionaron de 4 a 6 aves en 21 granjas avícolas comerciales, de pollas de engorde, ubicadas en diferentes municipios de los estados Aragua, Carabobo, Miranda y Cojedes, para un total de 21 muestras analizadas. En estas granjas las aves presentaron cuadros respiratorios compatibles con BIA.

Histología. La tráquea, pulmón y riñón de todas las aves fueron removidas durante la necropsia, y se fijaron con formol amortiguado a 10%, procesándose mediante la técnica descrita en el manual de técnicas histopatológicas y tinciones especiales, y teñidas con Hematoxilina Eosina, H&E (Armed Forces Institute of Pathology, 1960). Las muestras fueron observadas en un microscopio óptico a 40 y 100X.

El aislamiento viral se realizó en huevos embrionados de 9 a 11 días de edad, libres de anticuerpos específicos contra BIA. El inóculo se preparó a partir del macerado de tráquea, pulmón, riñón y tonsilas cecales de las aves que, en la necropsia, presentaron lesiones compatibles con BIA (21 muestras). Las muestras se procesaron según la técnica descrita por Gelb y Jackwood (1998).

Aislamiento del RNA. Se realizó mediante la técnica de extracción con Trizol Ls (Gibco BRL, NY), modificada (Wang et al., 1999). La modificación se basó en el uso de 5 μl de oligo (dT) cellulose (Gibco BRL, NY), con el fin de purificar el ARN. La técnica se explica: el RNA viral se obtuvo a partir de fluido alantoideo, en un tubo de centrifuga de 1,5 ml, se colocó 0,25 mi de fluido alantoideo, agregándose 0,75 ml de TRIzol ls.

La muestra fue incubada a temperatura ambiente por 5 min, adicionando 0,2 mi de cloroformo (CHC13), e incubándose a temperatura ambiente por 10 min, se centrifugó a 12000 r.p.m., por 15 min, la capa superior, fue transferida a un nuevo tubo añadiéndose 5μl de oligo(dT) cellulose y 0,5 mI de alcohol isopropílico, se incubó a temperatura ambiente por 10 min, centrifugándose a 12 000 r. p.m. a 4 °C por 10 min para la formación de un precipitado compacto (pellet), éste fue lavado con 1 mI de alcohol al 75%, centrifugado a 9 000 r.p.m., por 5 min y resuspendido, en 50 μl de agua ultra pura, tratada con dietil pirocarbonato, obteniéndose de esta manera el RNA purificado el cual se mantuvo en congelación a -30°C hasta el momento de ser usado para la RT-PCR.

RT-PCR-RFLP. Se realizó siguiendo el procedimiento de Kwon et al., (1993). Los iniciadores (primers, en inglés) utilizados (S1oligo5’ y S1oligo3’) fueron diseñados y sintetizados en la Universidad de Georgia (Molecular Genetics Facility) EE. UD., a una concentración final de 0,5 ng/ml).

Para la proteína N se utilizó el código y la secuencia siguiente: NIBVPCR. 5’ TGG CAC CGC TAC CTI CAAACTTGG GCG G 3’. Para la proteína M: MIBVPCR 5’ TAA GTC TIC AGT GGC TTG CTAAGT GTG AAC C 3’. Para la proteína SI: SIOLIG05’: TGA AAC TGA ACA AAA GAC y SI OLIG03’: CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA.

La RT-PCR se realizó utilizando el kit Titan^R (One Tube RT-PCR system, Boehringer Mannheim), y fue conducido en un termociclador Gene Amp PCR System 9600 y 2400 de Perkin Elmer, con el fin de amplificar los genes que codifican las proteínas estructurales del virus (N/M y S1), realizándose dos PCR individuales para N/M y S1, respectivamente.

La transcripción reversa (RT) se realizó por 1 h a 50°C. La amplificación fue realizada en 35 ciclos continuos de tres fases: desnaturalización a 94°C x 30 seg. La unión de los primers a 55°C x 30 seg, y polimerización a 68°C x 1,5 mino Como control positivo se utilizó el serotipo Mass y como negativo no se agregó ARN. El producto de esta amplificación fue corrido por electroforesis sobre un gel de agarosa al 1 %, Y observado en un transiluminador de luz ultravioleta.

Para el RFLP se utilizó el producto amplificado por PCR de la proteína S1, cortado por tres enzimas: BestY-I, Hae-III y Xcm-I. El producto de esta restricción se separó por electroforesis sobre un gel de agarosa a 2%, observado a través de luz ultravioleta para evidenciar y comparar con patrones de referencia del virus de BIA (Arkansas, Connecticut, JMK, Mass).

Todas las aves mostraron en el sistema respiratorio tráqueas con secreción que iban de clara transparente a catarral; en un caso se observó la traquea con congestión y secreción hemorrágica de grado moderado. En pulmones se observaron seis casos con focos neumónicos y sacos aéreos turbios.

En el sistema renal se observó en tres muestras, aumento de volumen del riñón de grado severo (06, 6228 Y 6328).

Respecto al intestino en todos los casos mostraron las tonsilas cecales con hemorragia leve.

En otros órganos, en tres casos hubo pericarditis, perihepatitis y peritonitis.

Las lesiones más consistentes en la tráquea fueron edema de la mucosa, degeneración del epitelio con pérdida moderada de cilios, en algunas zonas se observó hipertrofia e hiperplasia glandular de moderada a severa, se observó la formación de agregados linfoides, algunas zonas del epitelio presentaron células planas dando apariencia de metaplasia escamosa.

La lámina propia mostró edema moderado con infiltrado de tipo linfocítico predominante, también se observaron heterofilos y células plasmáticas. En el caso de las muestras 6228 y 6328 las lesiones fueron leves, caracterizadas por edema de la mucosa, pérdida parcial de cilios y congestión.

En el pulmón se observaron regiones con congestión hemorrágica leve, infiltrado linfocítico y heterofilico leve en el intersticio. La muestra 6228 presentó un proceso inflamatorio difuso denominado neumonía intersticial leve con infiltrado inflamatorio linfocitario.

Las muestras 06, 6228 y 6328 de los riñones, presentaron lesiones caracterizadas por nefritis intersticial severa con focos hemorrágicos y congestión, infiltrado mixto de tipo linfocítico principalmente, con heterófilos y algunas células plasmáticas (Figura 1).

Los túbulos se observaron dilatados, con cambios degenerativos hasta necrosis y pérdida de alguno de ellos (Figuras 1,2 y 3), se aprecia un material eosinofílico intatubular, aparentemente formando uratos (Figuras 2 y 3). En el glomérulo se observó necrosis y atrofia con adelgazamiento de la cápsula de Bowman. Se observó degeneración hidrópica severa en algunas áreas y hemorragia (Figura 2). No se observó fibrosis.

De un total de 21 muestras analizadas en el aislamiento viral, 12 aislados, corresponden a 57%, mostraron lesiones en embriones compatibles con las producidas por el virus de BIA, éstas consistieron en mal emplume, enanismo, encorvamiento, deformación de patas (Figura 4), en 9 muestras los embriones mostraron depósito de material blanquecino en uréteres y en riñones. En todas las muestras se necesitaron no menos de 2 pasajes ciegos para observar lesiones en embrión, lo que es característico de las cepas de campo. En 2 muestras, además del virus de BIA, se aisló el virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (6228 y 6246).

FIGURA 2. Riñón de aves afectadas por el virus de BIA observándose túbulos con degeneración hidrópica severa (Æ ) y necrosis aguda (… ), se aprecia la presencia de un material eosinofilico intratubular aparentemente formando uratos (â ), focos de hemorragia y congestión. H&E 1OOX.

La caracterización genómica en todas las muestras con aislamiento viral se amplificó el gen que codifica las proteínas N, M y S1 del virus de BIA. De las cepas que mostraron lesión renal, los patrones de RFLP determinaron que la cepa 06 pertenece al serotipo Mass y las cepas 6228 y 6328 al nuevo serotipo o "variante genotípica" aislado en el país por Brett et al., (2001).

En Venezuela las pérdidas ocasionadas por BIA a la industria avícola aún no han sido cuantificadas, siendo ésta, una de las patologías más comunes en los planteles avícolas y poco diagnosticada, esto posiblemente se deba a que la enfermedad puede presentarse en forma leve, y sólo se observan los signos clínicos consistentes cuando el cuadro se complica con agentes bacterianos generalmente (Erbeck y McMurray, 1998), lo que conlleva a un diagnóstico errado. En el estudio se aisló el virus de BIA en 57% de las muestras analizadas, lo que sugiere que el virus tiene una alta circulación en esta región.

FIGURA 3. Riñón de aves afectadas por el virus de BIA. Se observa degeneración y necrosis intratubular aguda con la presencia de un material eosinofilico intratubular aparentemente formando uratos (Ø ). H&E 100X.

Las lesiones histopatológicas observadas en el aparato respiratorio concuerdan con los resultados obtenidos por Purcell et al., (1976); Fulton et al. (1993); Ziegler et al., (2002) entre otros, estos autores señalan que todas las cepas estudiadas produjeron lesiones leves y moderadas, especialmente en tráquea, los cuales consistieron en daño al epitelio traqueal e infiltración de la lámina propia; siendo los daños en pulmón menos consistentes.

Las cepas 6228 y 6328, que en la necropsia presentaron lesión severa renal en las aves, produjeron lesiones leves en el tracto respiratorio, lo que concuerda con otros estudios (El-Houadfi et al., 1986; Fulton et al., 1993; Wang et al., 1996; Ziegler et al., 2002).

Por otra parte, la cepa 06, que en la necropsia también presentó lesión renal, causó lesiones moderadas en tráquea, en lo que podría considerarse las condiciones ambientales, sanitarias, correspondiente a la carga de microorganismo s patógenos presentes, capaces de exacerbar la enfermedad, o ser una característica per se de está cepa.

FIGURA 4. A la izquierda: embriones mostrando lesiones producidas por el virus de BIA, como lo son enanismo, mal emplume y encorvamiento. A la derecha embriones controles.