Veterinaria Trop. 28(1): 37-48. 2003

*Investigadores y
**Técnicos Asociados a la Investigación. INIA.
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP).
Instituto de Investigaciones Veterinarias. Sanidad Animal.
Apartado 70. Maracay 2102, estado Aragua. Venezuela.

***Profesora.
Universidad Central de Venezuela.
Facultad de Ciencias Veterinarias.
Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.

Recibido: octubre 09, 2003.

Se caracterizaron dos cepas del virus de la enfermedad infecciosa del bursa (EIB) aislada de pollos de engorde en Venezuela. La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR), se utilizó en la transcripción y amplificación de un producto de 248 pares de base que abarca la región hipervariable del gen VP2 (que codifica la proteína) del virus de la EIB. Para el estudio del Polimorfismo en la longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP), el producto de RT-PCR de 248 pb se sometió a la digestión con las enzimas de restricción Dra 1, Sac 1, Sty 1, Ssp I y Taq 1. La cepa P:6228 sólo fue digerida con la enzima Sac I que corresponde con el perfil de las cepas clásicas, mientras el producto de la cepa P:6792 fue digerida con las enzimas Sac I y Taq 1, perfil que identifica las cepas variante E. Ninguna de las cepas mostró la digestión con la enzima Ssp I que identifica las cepas muy virulentas.

Palabras Clave: Enfermedad infecciosa del bursa; RT-PCR-RFLP; caracterización molecular.

La enfennedad infecciosa del bursa (EIB) es una enfennedad aguda altamente contagiosa de los aves jóvenes, siendo las aves de 3 a 6 semanas las más susceptible, aúnque puede afectar aves de menor edad. La enfermedad fue descrita por primera vez por Cosgrave (1962) y es causada por un virusARN segmentado de doble cadena perteneciente a la familia Bimaviridae (Nick et al., 1976).

El virion es icosaedrico, desnudo y con un diametro de 58-60 nm (Jackwood et al., 1982). En Venezuela el primer aislamiento del virus de la EIB se realizó a partir de pollos de engorde del oriente del país (Quiroz et al., 1984), identificándose dos serotipos del virus de la EIB I y II (Jackwood y Saif 1987; McFerran et al., 1980), sin embargo, se observan variantes del serotipo I (Jackwood y Jackwood, 1997; Takeshita, 1998; Banda et al., 2001; Ramos et al., 1996; Noguera et al., 2002).

El virus del la EIB afecta el sistema inmune de las aves causando inmunosupresión (Allan et al., 1972; Faragher et al., 1974), con las consecuentes pérdidas económicas, en primer lugar por la clínica de la enfermedad y en segundo lugar, la cual es considerada la más importante por la inmunosupresión severa y prolongado que causa en las aves infectadas a temprana edad (Lukert y Saif, 1997), predisponiendo a las mismas a sufrir infecciones bacterianas yvirales, así como fallas en las vacunaciones (Yuasa et al., 1980), por la incapacidad del ave para responder a la aplicación de las vacunas (Quiroz, 1999).

A pesar de que el virus de la EIB reduce la capacidad de opsonización de los anticuerpos, este efecto se incrementa marcadamente cuando está presente el virus de bronquitis infecciosa aviar (Naqi et al., 2001), quedando las aves predispuestas a sufrir infecciones del tracto respiratorio como las causadas por E. Coli.

Las cepas del virus de la EIB pueden ser identificadas mediante el uso de la prueba de virus-neutralización por la inoculación de huevos embrionados (Jackwood y Saif, 1987; Rosenberger et al., 1998). Igualmente los anticuerpos monoclonales han sido utilizados para conocer las bases moleculares de la variación antigénica de cepas del virus de la EIB (Vakhria et al., 1994) y en la caracterización antigénica y molecular de cepas de campo del virus de la EIB (Sellers et al., 1999).

La identificación molecular de cepas del virus de la EIB utilizanda la Transcriptasa Reversa (RT)-Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) - Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP), se señala en numerosas investigaciones (Banda et al., 2001; Banda et al., 2003; Jackwood y Jackwood, 1997; Jackwood y Sommer, 1997; Ture et al., 1998; Jackwood y Nie1sen, 1997; Majó et al., 2002; Ikuta et al., 2001).

Existen trabajos (Phong et al., 2003) del uso de la técnica de PCR anidada con transcripción reversa e inmuno ensayo asociados a enzimas para la detección de la región hipervariable de la proteína VP2, la cual mostró una especificidad del 100% y la capacidad de detectar bajas concentraciones del virus.

Investigaciones recientes, han permitido diferenciar cepas vacuna1es y cepas de campo del virus de la EIB, mediante el uso de la enzima de restricción NgoM IV, siendo considerado como un marcador genético, (Jackwood et al., 2001; Jackwood y Sommer, 2002), ya que la digestión del cDNA con esta enzima se detectó en cepas virulentas de campo, así como en cepas virulentas del virus utilizadas en la elaboración de vacunas, encontrando que el cDNA de las cepas no virulentas no son digeridas con esta enzima.

El objetivo de este trabajo es señalar la caracterización molecular de dos cepas del virus del EIB aisladas de pollos de engorde utilizando la técnica de RT-PCR-RFLP.

Se utilizó la técnica de RT-PCR-RFLP (Majó et al., 2002) en la caracterización molecular de dos cepas del virus del EIB, a partir de bursas de aves que presentaban signos clínicos y lesiones macroscópicas y microscópicas compatibles con las causada por el virus de EIB, dichas cepas fueron identificadas P=6228 y P=6792.

Pools de 5 bursas de cada una de las muestras se maceraron en un tubo tembroock agregando 3 mI de la solución O completa que contiene guanidina tiocianato 4,23M, citrato de sodio 26,4mM, sarcosina 0,53%, B mercapto etanol 0,0076% yagua tratada con dietil pirocarbonato (DEPC), incubándose en baño de María a 37 °C durante 10 min y a 60 °C por 10 min.

Se centrifugaron a 14000 rpm por 3 min, tomando 100 μl del sobrenadante, para mezclar con 400 μl de fenol (pH 4,3), 400 μl de solución D completa, 80 μl de cloroformo alcohol-isoamílico y 40 μl de acetato de sodio. Posteriormente todo fue mezclado en un vortex, mantenido en hielo 15’ y centrifugado a 14000 rpm por 3 mino La capa superior se tomó y puso en un tubo nuevo con 500 μl de Isopropanol, congelándose a -20°C durante 1 h para centifugarse a 14000 rpm por 10 min.

Se descartó todo el sobrenadante, restituyendo el pellet en 80 μl de Etanol al 75%, donde se centrifugó a 14000 rpm en 3 min, repitiendo el proceso 2 veces más, luego se descartó el sobrenadante, centrifugándose a 14000 rpm por espacio de 5 mino Fueron agregados 50 μl de dimetil sulfoxido (DMSO) al 90% y las muestras conservadas en congelación a -70°C hasta el momento de montar la técnica de RT-PCR.

Para realizar la técnica se tomó 1,0 μl de la muestra conservada en DMSO, colocándose en el Termociclador a 98 °C/5’ para su desnaturalización. Posteriormente se realizó la técnica de RT-PCR, utilizando una mezcla para la RT que contenía 2 μl de buffer, 0,12 μl de Transcriptasa Reversa M-MLV, 0,22 μl de RNAsin, 1,0 μl de dntp's, 4,66 μl de H20 tratada con dietilpirocarbonato, 1 μl de Primers y la mezcla para el J:>CR contenía 1,8 μl de MgCl₂ 0,025M; buffer 5 μl; Taq polimerasa 0,2 μl; H20 tratada con dietil pirocarbonato 32 μl y primers 1 μl. En la técnica se usaron dos tipos de primers, el 5’ GTAACAATCACACTGTICTCAGC 3’ utilizado en la mezcla para la RT y e15’ GATGTAACTGGCTGGGTIATCTC 3’ para la mezcla del PCR.

A la muestra desnaturalizada se le agregaron 9 μl de la mezcla para RT y 40 μl de la mezcla para PCR, los tubos con la mezla se colocaron en el termociclador para realizar el proceso de transcripción inversa y amplificación, utilizando un termociclador Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400.

La transcripción inversa se realizó a 37°C, 1 h. En la amplificación se utilizó el programa siguiente: 1 ciclo a 94°C, 3 min; 40 ciclos a 94°C por 40 segundos, 55°C, 1,5 min; 72 °C, 1 min y 1 ciclo a 72 °C durante 5 mino Con el RT-PCR se amplificó una secuencia de 248 pares de base (Pb) del gen VP2.

Al final del proceso se comó una electróforesis para visualizar el producto del RT-PCR, utilizando un gel de agarosa al 2% y coloreado con bromuro de etidio, utilizando como marcador de peso molecular un ladder de 100 pb.

El producto de 248 pb obtenido del RT-PCR se sometió a la digestión con las enzimas de restricción Ora I , Sac I, Sty I, Ssp I y Taq I. Las enzimas se usaron a una concentración de l0U/μl , por lo tanto la mezcla para la digestión contenía 1 μl de cada una de las enzimas, 2 μl de buffer, 2 μl de la muestra y se completó con H₂O para biología molecular hasta obtener un total de 20 μl, las mezclas se dejaron en incubación a 37°C por una noche.

Para conocer los resultados de la digestión, se montó una electroforesis utilizando un gel de agarosa al 2% y coloreado con bromuro de etidio y el mismo marcador de peso molecular usados en la RT-PCR.

Han sido numerosos los trabajos realizados con la técnica de RT-PCRRFLP en la caracterización de cepas del virus de la EIB utilizando bandas de diferentes tamaños de acuerdo con el número de aminoácidos. Jackwood y Sommer (1998) clasificaron cepas vacunales y de campo del virus de la EIB en cinco grupos moleculares, utilizando un fragmento de 743 pb Y encontrando una alta heterogenicidad entre las cepas.

En este estudio la presencia del virus en las muestras procesadas fue confirmado con la formación de una banda entre 200-300 pb observada en la electroforesis del producto obtenido en la transcripción y amplificación. Algunos autores han realizado la caracterización molecular de cepas del virus de la EIB utilizando un producto de tamaño similar al usado en esta investigación (Banda et al., 2001; Bruta et al., 2001; Majó et al., 2002; Banda et al., 2003), mientras que otros investigadores (Jackwood y Jackwood, 1994, 1997; Ture et al., 1998) trabajaron con 394 pb Y 743 pb, respectivamente, por su parte Meir et al. (2001), trabajó con un fragmento de 771 pb, siendo utilizados en todos los casos, fragmentos de diferentes tamaños en la caracterización molecular de cepas del virus del EIB, procedentes tanto de cepas de campo como vacunales.

En el Cuadro se presentan los resultados del RT-PCR y de la digestión con las enzimas de restricción (RFLP) del producto obtenido con la amplificación por medio del RT-PCR. Como se observa en el Figura 1, la cepa 6792 fue digerida con las enzimas Sac I y Taq I, resultados similares a los obtenidos en este estudio son presentados en otras publicaciones (Jackwood y Jackwood, 1994, 1997; Jackwood y Nielsen, 1997; Banda et al., 2001), correspondiendo las cepas con este patrón de restricción a las cepas variante E, la cual ya había sido señalada en el país (Ramos et al., 1996; Noguera et al., 2002).