Veterinaria Tropical 05: 5-9. 1980

*Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado
Escuela de Ciencias Veterinarias Apartado postal 400
Barquisimeto 3001A, Venezuela

RESUMEN

Ovinos criollos fueron infectados endovenosamente con estabilizados de Tripanosoma vivax americano, cepa Carora, que poseían diferente tiempo de criopreservación (3 y 4 años respectivamente ). La evolución de la infección se evaluó en base a las variables temperatura corporal ya la periodicidad e intensidad de la parasitemia. El análisis estadístico demostró que no existían diferencias significativas entre las variables estudiadas. El curso de la infección fue semejante al descrito por otros autores para T. vivax no criopreservado (fases febriles y afebriles coincidiendo con períodos de parasitemia y negatividad). Se sugiere que el método de criopreservación usado no altera la patogenicidad y la infectividad de esta cepa de T. vivax entre poblaciones congeladas por 3 y 4 años.

INTRODUCCION

El Trypanosoma vivax americano, hemoflagelado con mayor prevalencia y patogenicidad en rebaños bovinos en Venezuela y otros países tropicales del continente americano 20, presenta al investigador dificultades y limitantes para ser mantenido en el laboratorio por las razones siguientes: a) no es cultivable en medios axénicos monofásicos ni difásicos, b) es apatógeno, no se multiplica, no sobrevive en animales de laboratorio y c) sólo puede ser mantenido en rumiantes mediante infección experimental con jeringa, lo cual es costoso. Sólo la subespecie T. vivax africana ha sido mantenida "in vitro" con moderado éxito en un medio de cultivo de tejidos de Glossina palpalis¹⁹.

CUNNINGHAM y HARLEY³ introdujeron en 1962 la técnica de criopreservación para el mantenimiento de las formas metacíclicas de Trypanosoma brucei; posteriormente esta técnica fue también usada para criopreservar otros hemoflagelados, tales como: T. gambiense, T. congolense, T. vivax  africano y T. cruzi ⁴ , además de mejorarla al utilizar microtubos plásticos para linfa como envases ("palletas"). Desde entonces la técnica de criopreservación, realizada con nitrógeno (N2) líquido a -196 °C, ha tomado auge y para la conservación de cepas de T. vivax es de gran utilidad.

Este trabajo tuvo como objetivo estudiar la viabilidad del T. vivax americano en la forma siguiente: a) evaluar el curso de la infección en ovinos infectados experimentalmente y b) analizar si el de hemoparásitos criopreservados (denominados en este trabajo estabilizados ) a -196°C, altera la patogenicidad y/o morfología del T.vivax americano. Para ello dos poblaciones de este hemoparásito, cepa Carora, fueron criopreservados en tanque con N2 líquido a -196 °C durante 3 y 4 años.

MATERIALES Y METODOS

ANIMALES.

Dos ovinos, de 1 año de edad, raza criolla, adquiridos en una finca cercana a Barquisimeto, fueron estabulados en un ambiente cerrado ya prueba de moscas. Los ovinos fueron identificados como OP1 y OP2 y alimentados con concentrado comercial y agua ad.lib. A fin de constatar que estaban negativos a T.vivax, sangre capilar fue examinada diariamente y por 7 días, mediante exámenes directos y frotis coloreados con Giemsa.

T. vivax AMERICANO.

En este trabajo se usó la cepa Carora mantenida en el laboratorio desde 1973. La fuente y forma de aislamiento de esta cepa y la secuencia de sub-fases realizadas en rumiantes, fueron descritas previamente¹⁵.

CRIOPRESERVACION.

Las poblaciones de T. vivax americano fueron criopreservadas en N₂ líquido a -196°C siguiendo la técnica descrita por DAR y col.⁶ con ligeras modificaciones. Brevemente el procedimiento consistió en lo siguiente: un volumen conocido de sangre venosa de un ovino, infectado experimentalmente con T. vivax  y extraída durante el primer "pico" de parasitemia, fue mezclada con un 8% de glicerol, utilizado como crioprotector. La mezcla fue envasada en las palletas y estas selladas en un extremo con alcohol polivinilíco. Luego las palletas fueron  mantenidas a temperatura ambiente de 22 °C, por 15 minutos, posteriormente fueron colocados en un envase cilíndrico de cartulina (9 cm x 1 cm) que fue introducido y mantenido en suspensión en el tanque de N₂ líquido, sin tocar la fase líquida, durante 30 minutos. Finalmente todas las palletas fueron depositadas en una canastilla metálica que fue introducida en la fase líquida del N₂ congelándose a -196 °C. Por medio de esta técnica y en esas condiciones los estabilizados de T. vivax a usar, se mantuvieron viables en este laboratorio por 3, 4 y más años.

INOCULACIÓN EXPERIMENTAL.

Varias palletas con sangre positiva a T. vivax , criopreservado por 3 años, fueron descongeladas hasta completar un volumen de 1 ml. Previa verificación microscópica de la viabilidad del hemoflagelado, este inóculo de 1 ml fue administrado endovenosamente (EV) al ovino OP1. El ovino OP2 recibió igual volumen por vía EV pero del estabilizado criopreservado por 4 años. El día de inoculación fue denominado día cero (0). La temperatura corporal de cada animal fue chequeada a partir del día -3 hasta el día + 50 post-inoculación (PI).

EVALUACIÓN DE LA PARASITEMIA.

Esta fue medida a partir del día + 1 y durante 50 días consecutivos mediante el método de "la comparación" de HERBERT y LUMSDEN⁸, el cual permite hacer un estimado de la intensidad de la parasitemia.

FROTIS SANGUÍNEO.

Fueron realizados cada tres días a fin de estudiar la morfología del T. vivax americano. Los frotis, previa fijación con metanol, fueron coloreados con Giemsa diluído en una solución buffer, pH 7,2. 

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Las variables parasitemia en el ovino OP1 inoculado con T, vivax americano, criopreservado por 3 años, y la parasitemia en el OP2, inoculado con el estabilizado de 7: vivax criopreservado por 4 años, fueron sometidos al análisis estadístico mediante el test "t" o "studentis  test"¹⁸.

RESULTADOS

El  T. vivax americano mostró un período de incubación, en los ovinos inoculados, que osciló entre los valores conocidos para cepas no estabilizadas, es decir, 5 días en OP1 y 6 días en OP2. El primer gran "pico" de parasitemia fue detectado a los  60 y al 80 día PI en OP1  y OP2, respectivamente. Los períodos de parasitemia se alternaron con períodos de negatividad en ambos ovinos y la frecuencia de las fases de parasitemia, así como otras características del curso de esta tripanosomiasis experimental, se presenta en el Cuadro 1.

Las fases de parasitemia detectadas en OP1 tuvieron una duración de 3 -13 días, mientras que en, OP2 éstas oscilaron entre 3 -7 días. Es de destacar que en OP1 la máxima positividad encontrada (48 T. vivax por campo microscopio a 400 x) ocurrió el día 28 PI, mientras que en OP2 se detectó el día 49 PI.

En el Gráfico 1 se observa el curso de la parasitemia en los ovinos OP1 y OP2, inoculados con estabilizados de T. vivax americano que fueron criopreservados por 3 y 4 años, respectivamente. Las fases de parasitemia y negatividad se evidencian fácilmente y se nota que en OP1 las parasitemias aparecían 1 -2 días antes que en OP2. El análisis estadístico aplicado a la variable intensidad de la parasitemia en OP1 y OP2, no mostró diferencias significativas entre ellas (t = 1,323 ; P > 0,05). La Gráfica 2 señala el curso de la temperatura corporal en los ovinos inoculados: OP1 mostró el día 23 PI su máximo acceso febril (42,1°C), mientras que en OP2 esto ocurrió el día 20 PI y fue de 42,2°C.

Grafica 1. Curso de la Parasitemia en ovinos infectados con  Tripanosoma vivax  Americano, criopreservado por 3 años (OP1) y por 4 años (OP2). La flecha señala el día de la inoculación (día 0). OP1:___________ OP2:--------------------

Grafica 2. Cursor de la temperatura corporal de ovinos infectados con Tripanosoma vivax Americano criopreservado por 3 años (OP1) y por 4 años (OP2). La flecha señala el día de la inoculación (día 0). OP1:___________ OP2:--------------------

El T.vivax americano exhibió monomorfismos durante todo el curso de la infección, así como también presentó su morfología típica con extremo posterior redondeado. Su longitud se mantuvo constante y coincide con los valores comunicados por otros autores para Venezuela¹², Colombia¹⁶ y Brasil¹⁷. La longitud media fue 21,8 micras (variación: 19,5 -24 micras). La única diferencia detectada fue en relación a la anchura del tripanosoma (medida a nivel del núcleo), así los especímenes medidos provenientes de la vena yugular eran delgados (media: 1,6 - micras; variación: 1,5 -1,8 micras). comparados con aquellos provenientes de sangre capilar que eran más anchos (media: 2,8 micras; variación: 2,2- 3,0 micras).

Discusión

La criopreservación es una alternativa válida para lograr mantener estabilizadas y viables poblaciones de Trypanosoma vivax , otros tripanosomas y otros protozoos en el laboratorio¹⁴. No obstante, existen algunas excepciones como Toxoplasma gondii, el cual pierde su capacidad de infectar ratones después de ser criopreservado en nitrógeno líquido⁹.

En el caso de los protozoos criopreservables es recomendable evaluar si su morfología, infectividad y viabilidad son afectadas adversamente por la congelación a -196°C. Estas evaluaciones fueron emprendidas por otros autores ^6/4 quienes usaron el T. vivax africano, T. brucei  y/o T. congolense.

El método de congelación señalado por DA R y col.⁶ recomienda descender la temperatura a razón de 20 °C/minuto, velocidad a la cual parece ser que la infectividad del T. vivax africano no se afecta después de haber estado criopreservado durante 4 semanas. Un método de congelación semejante al descrito por DAR y col.⁶, fue usado en este experimento. Sin embargo, las poblaciones de T. vivax americano a evaluar habían permanecido criopreservados durante 3 y 4 años respectivamente. Los resultados estadísticos obtenidos mostraron diferencias mínimas no significativas en poblaciones del hemoflagelado criopreservado por 3 y 4 años, lo que permite afirmar que el método de congelación usado es eficaz y de primera opción en el mantenimiento de protozoos, especialmente los no cultivables como el T. vivax. 

El Gráfico 2 muestra el curso de la temperatura corporal, suscitándose períodos piréticos alternados con fases apiréticas. Esta alternabilidad es "normal" y refleja el curso conocido para la temperatura corporal en rumiantes infectados con T. vivax ^12/17, donde los períodos febriles coinciden con los "picos" de parasitemia y con la correspondiente detección del T. vivax en sangre periférica. Las bases inmunológicas y los principios antigénicos que determinan esa alternabilidad (febril -no febril; parasitemia -negatividad) en el curso de la infección con T. vivax son conocidas ^5/10/11.       

Se puede decir que ese curso es una reacción fisiológica a la capacidad de variabilidad antigénica del T. vivax (producción periódica de diferentes antígenos variables o de la superficie) con la consecuente formación de: a) nuevas subpoblaciones de T. vivax que escapan temporalmente al control inmunológico desarrollado por el rumiante, manteniéndose así la infección, y b) estimulación constante de los mecanismos de la inmunidad humoral, lo cual conduce a un incremento notable de la IgM en rumiantes ^1/2/13.

Es difícil emitir una opinión en cuanto a las diferencias morfológicas (anchura) observadas en T. vivax americano de sangre capilar y de sangre venosa yugular, así como también opinar en cuanto al significado de estas diferencias. FAIRBAIRN ⁷ notó que la longitud del T. vivax americano variaba influenciada por el hospedador y que las diferencias en longitud estaban asociadas a diferencias en patogenicidad de las cepas. En este trabajo no se detectaron diferencias en cuanto a la longitud del T. vivax americano.

SUMMARY

Two stabilates of a South American strain of Trypanosoma vivax having different time of cripreservation (3 and 4 years respectively), were separetely injected by the intravenous route into two native sheep. The course of the infection was monitored assessign the variables body temperature, and the frecuency and intensity of the parasitaemia in each sheep. The statistical analysis showed no significat diferences among the variables studied. The infections had a chronic relapsing course similar to the one described in the literature for infections caused by non-criopreserved T. vivax. It is suggested that the cripreservation method used, does not modify the infectivity and pathogenicity of these T. vivax stabilates either criopreserved for 3 or for 4 yearse.

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