Veterinaria Tropical, 6: 23-29. 1981

RELACIÓN ENTRE LA ACTIVIDAD DE LA FOSFOLIPASA B  y LA CARGA PARASITARIA EN INTESTINO DELGADO DE RATONES INFECTADOS CON Nippostrongylus brasiliensis

ROGER LÓPEZ BOYER* y E. V. DEBuysSCHER**

*FONAIAP .Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Agropecuarias. Apdo. 70. Maracay 2101. Venezuela.
**University of Georgia. Athens. Georgia. U.S.A.

Recibido: Abri112, 1982.

RESUMEN

Ratones de la línea CD-1 fueron inoculados con 500 larvas infectantes de Nippostrongylus brasiliensis, los cuales mostraron una elevación de los niveles de fosfolipasa B en el intestino delgado desde el día 8 al 14 después de la exposición. El aumento de la actividad enzimática estuvo relacionado con la carga parasitaria en el intestino. Esta respuesta fue similar a la encontrada por otros investigadores en roedores infectados con otros parásitos helmintos, por lo que se piensa que la fosfolipasa B no es única para los modelos de roedores y que forma parte probablemente de la compleja respuesta inmune del huésped en la defensa contra los helmintos a nivel intestinal. En adición a este experimento, es demostrable la exactitud en el contaje de larvas adultas en una mitad de intestino delgado, y no hay diferencias significativas en el promedio de adultos contados en cada una de las dos mitades del intestino delgado del ratón.

INTRODUCCIÓN

La expulsión de los parásitos gastrointestinales ha sido señalada como el resultado de mecanismos complejos en los cuales pueden estar involucrados procesos inmunológicos y no inmunológicos ⁹. La estrecha relación entre la presencia de parásitos en el intestino delgado y la elevación de los niveles de fosfolipasa B 

en el mismo tejido fue primariamente demostrado por OTTOLENGHI en 1973⁷. Esta asociación ha sido confirmada en ratas y ratones expuestos con Trichinella spiralis⁵.

Los estudios con este parásito han demostrado también una estrecha correlación entre la inflamación intestinal y los niveles de fosfolipasa B en el tejido intestinal, acompañado de un aumento en la producción de eosinófilos en la médula ósea. Estas observaciones forman parte de la hipótesis que sugiere que las células T (derivadas del timo), después de interrelaccionar con el antígeno, liberan un factor quimiotáctico de los eosinófilos, posiblemente a través de la producción de una linfokina, el cual dirige esas células al área de inflamación, existiendo entonces una estrecha relación entre fosfolipasa B y eosinófilos⁸. La acumulación de esta enzima se toma como una indicación de la participación de estas células en la reacción local, así como por el hecho de que la inflamación está asociada con la expulsión de las larvas¹.

La fosfolipasa B podría estar asociada directa e indirectamente a este fenómeno. Es posible que esta enzima esté envuelta en la síntesis de prostaglandina las cuales han demostrado tener un efecto directo en la expulsión de los parásitos gastrointestinales. El propósito de este trabajo es confirmar el aumento de los niveles de actividad de la fosfolipasa B a nivel intestinal y su relación con la carga parasitaria, usando como modelo la línea de ratones CD-1 y el parásito Nippostrongylus brasiliensis. Igualmente demostrar que puede trabajarse con la mitad longitudinal de un intestino delgado de ratón, por haber correlación entre éste y el intestino delgado total en cuanto a la carga parasitaria, usando como modelo el nemátode Nippotrongylus brasiliensis.

MATERIALES Y MÉTODOS

PREPARACIÓN DEL TEJIDO INTESTINAL

Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical; los intestinos delgado fueron separados, y luego de retirar los tejidos adyacentes fueron divididos en segmentos de 8-12 cm de longitud y lavados brevemente con agua fría para retirar el contenido intestinal. Los segmentos se secaron y los remanentes de tejidos adheridos fueron cortados.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA FOSFOLIPASA B

Se escogió como sustrato la lisolecitina debido a su estabilidad, amplio rango de pH y la fácil dispensión en el buffer. Fue utilizada a la concentración de 20 µ M/ml y graduados en alícuotas de l0 ml y mantenidos a -l5°C. Antes de su uso fue descongelado en baño de maría a 37oC.

Para la determinación de la actividad de la fosfolipasa B fue utilizado el método descrito por OTTOLENGHI y col. con pequeñas modificaciones hechas por GOVEN^4/3. Se homogeneizaron 12,5 g de intestino en buffer glicerol al 12,5%; 50 micromoles de esta muestra se incubaron en baño de maría a 37°C por 5 minutos. La reacción se inició por la adición de 0,3 ml de lisolecitina a la concentración de 2 x 10-3M. La reacción blanco fue una muestra incubada sin lisolecitina. Las muestras fueron incubadas por 60 minutos. La reacción se detuvo con la adición de 0,1 rol de 2N de H₂S0₄. Los ácidos grasos fueron extraídos por la adición de 2,9 ml de heptano.

TlTULACIÓN

La titulación de los ácidos grasos se hizo con NaOH 0,01 N. Se utilizó una corriente de burbujas de gas carbónico a través de la solución, para expeler el di óxido de carbono y mantener la mezcla de las dos fases durante la titulación.
El punto de la titulación se alcanzó cuando el color viró de rosado a azul. La actividad de la fosfolipasa B fue calculada como micromoles de lisolecitina hidrolizada por gramo de tejido seco por hora.

RATONES DE EXPERIMENTACIÓN

Fueron obtenidos de la Compañía Charles River, USA, y luego mantenida la línea en el laboratorio.

CEPA DE Nippostrongylus brasiliensis.

La cepa fue cedida por el Dr .Jacobson, Departamento de Medicina Preventiva, Comell University. Estas larvas fueron mantenidas en el laboratorio siguiendo el protocolo del mismo departamento, mediante el pasaje de larvas infectantes a los ratones vía subcutánea, a razón de 300 larvas infectantes en 0,1 rol de Tioglicolato y gelatina al 2,5%, más antibiótico.

EXPERIMENTACIÓN

Para determinar la relación existente entre la carga parasitaria y los niveles de actividad de la fosfolipasa B en el intestino delgado, fueron realizadas dos experiencias:

1) Para conocer la carga parasitaria fueron inoculados 36 ratones con 500 larvas infectantes de Nippotrongylus brasiliensis contenidos en 0,1 ml vía subcutánea y sacrificados en grupos de 6 los días 4, 5, 8, 11, 14 y 18, respectivamente. Se extrajo el intestino delgado de cada uno de los ratones y fueron contados los vermes adultos. Estos resultados se señalan en el Cuadro 1.

2) Para determinar los niveles de actividad de la fosfolipasa B, 24 ratones fueron inoculados con 500 larvas infectantes (L3) de Nippostrongylus brasiliensis vía subcutánea; el nivel fue determinado los días 5,8,11,14,17, 20,23 y 28 después de la inoculación. Los resultados se presentan en el Cuadro 2.

Una experiencia adicional fue llevada a cabo para conocer la relación de los niveles de carga parasitaria existente entre el intestino delgado completo y la mitad longitudinal del mismo. Para ello, 36 ratones de la línea CD-l fueron inoculados con 500 larvas infectantes (L3) de Nippotrongylus brasiliensis contenidos en 0,1 ml vía subcutánea. Fueron sacrificados en lotes de 6 los día 4,5,8,11,14 y 18, respectivamente. Fueron separados los intestinos delgados en cada grupo de ratones. En un grupo, el intestino delgado fue cortado longitudinalmente en dos y en cada mitad fueron recobrados y luego contados los vennes adultos. Igual procedimiento se siguió en el intestino completo. Los resultados aparecen en el Cuadro 3.

RESULTADOS

En cuanto a la experiencia 1, se observó que a partir del día 4 empiezan a aparecer los vennes adultos (L5), ascienden en número hasta alcanzar un pico el día 14, para caer abruptamente el día 18 (Cuadro 1). Esto coincide con los resultados obtenidos por otros investigadores en ratones inoculados con cepas de Nippotrongylus brasiliensis⁶.

En la segunda experiencia se observa en los ratones infectados una elevación de los niveles de actividad de la enzima desde el día 8, hasta llegar a niveles altos los días 11 y 18, con un pico el día 14 (Cuadro 2). La actividad fue declinando hasta aproximarse a los niveles primarios de infectación alrededor del día 28. Comparando esta experiencia con la primera se observa una correlación entre los días de mayor carga parasitaria con los días de aumento de los niveles de actividad de la fosfolipasa B. El mayor número de vermes adultos (L5) recobrados fue en los días 11 y 14, y este período coincide con los aumentos de actividad de la enzima en el intestino delgado.

DISCUSIÓN

La relación entre la actividad de la fosfolipasa B y el parasitismo ha incrementado el interés acerca del rol de los procesos inflamatorios en la defensa del huésped a la acción de los parásitos gastrointestinales. Aunque no existen  pruebas directas, es posible que la enzima pueda ser parte de un mecanismo común del  huésped para controlar la infestación. Esto podría ocurrir en dos formas: por la interreacción de la enzima con los fosfolípidos de la membrana de las células intestinales expuestas al tejido dañado, originando la formación de ácidos grasos libres, precursores de las prostaglandinas, las cuales causan expulsión y un efecto metabólico directo. Igualmente, es posible que la enzima pueda actuar sobre el parásito causándole un daño directo ^1/4/2/3.

En relación con los resultados obtenidos, es necesario continuar los estudios en este campo, para dilucidar la función de la enzima en esta relación huésped- parásito.

Con respecto a la correlación existente entre la mitad longitudinal de intestino delgado y el intestino delgado completo de ratones, y los niveles de carga parasitaria, los resultados son una base para futuros ensayos en esta área, como es la posibilidad de estudiar simultáneamente la acción de un suero antifosfolipasa B y antieosinófilo y, colateralmente a nivel del mismo intestino, la determinación histoquímica de la fosfolipasa B y la migración de los eosinófilos al área afectada.
Finalmente, se propone la utilización de un animal de más fácil manejo y más económico a nivel de laboratorio para proseguir los estudios.

SUMMARY

Mice of CD-l line given a initial infeccion of  500 infective larvaes of  Nippostrongylus brasiliensis showed elevated phospholipase B levels in the small intestine from 8 through 14 days after challenge. The increase in enzime activity was correlated with worm burden in the small intestine. The response was similar to that found for other workers in rodents infected with helrnints parasites, and the phospholipase B is no unique to rodents models and is probably part of the complex inmune response of the host in the defense against parasitic infections. In adition to above experiments, it is demostrable that accurate adults counts can be made using one-half of small intestine, and there were not significant differences in the average numbers of adult worms counted in either half of the small intestine.

BIBLIOGRAFÍA

1.- DINNEN, J. K. and KELLY J. D. Levels of prostaglandins in the small intestine of rats during primary and secondary infection with Nippostrongylus brasiliensis. Inst. Arch. Allergy Apply Immunolo. 51: 429-440. 1976.

2.- GOETZL, E. J. and AUSTEN, K. F. Cellular characteristics of the eosinophils compatible with a dual role in host defense in parasitic infections. Am. J. Tropic. Med. Hyg. 26: 142-150. 1977.

3.- GOVEN. A. J. and DeBUYSSCHER, E. V. Intestinal Phospholipase Bactivity in swine ninoculated withn Trichinella spirualis. Am.J. of Vet. Res. 40: 1469-1471. 1979.

4.- KELLY. J. D. and DINNEN. J. K. Prostaglandins in the gastrointestinal tract: Evidence of a role in wormexpulaion. Aust. Vet.J. 52: 321.401. 1976.

5.- LARSH. J. E.; et al. TrlchlnellG 8plral/s: Phospholipase in challenged mice and rats. Experimental Parasirology. 36: 299-306. 1974.

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7.- OTTOLENGHI, A. High phospholipase content of intestines of mice infected with Hyminolepis nana. 8: 426-428. 1979.

8.. OTTOLENGHI. A. The relation ship between eosinophi1ic leukocytes and phospholipase B activity in some rat tissues. Lipids.      5: 531-538. 1970.

9.- WAKEUN, D. Immunity to intestinal parasites. Nature (London). 27g: 617-620. 1978.