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Veterinaria Tropical, 6: 45-57. 1981

AISLAMIENTOS DE Brucella abortus BIOTIPO 1 EN CHIGUIRES 
(Hjdrochoerus hydrochaeris)
(ESTADO APURE, VENEZUELA)

VERÓNICA R. DE LORD*, ANÍBAL BELLO N.*, JAVIER MORENO*,
RUBIELA DE LASERNA* y JUDITH DE RAMOS*


*FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias.
Apdo. 70; Maracay 2101, Venezuela.

Recibido: Noviembre 30, 1982.


RESUMEN

Con el propósito de intentar aislamientos de Brucella spp, en 1979 se realizó un estudio en chigüires (Hydrochoerus hydrochaeris) en el Hato Las Trincheras, Estado Apure, Venezuela. Un total de 94 chigüires fueron necropsados y 376 muestras de bazo, hígado y ganglios mesentéricos y retrofaríngeos fueron examinados. Se aislaron diez cepas de Brucella a partir de 49 machos y tres cepas de 45 hembras. Todas las cepas fueron sometidas a la prueba de sensibilidad a colorantes, pero solamente seis resultaron ser Brucella abortus Biotipo I. Así mismo, se determinó la distribución de aislamientos de Brucella de acuerdo a la edad de los animales, la cual fue estimada mediante la técnica del cristalino. La alta proporción de infección (18,8 %) fue encontrada en animales con edades comprendidas entre 11 y 20 meses. Estos hallazgos sugieren que este roedor puede ser considerado de importancia en la transmisión de brucelosis cuando convive con animales domésticos.


INTRODUCCION

La brucelosis es una enfermedad ampliamente distribuida en países en desarrollo y se ha demostrado que numerosas especies de animales silvestres son susceptibles a la infección por diferentes especies del género Brucella 5/26/27/3/2/4/6 existiendo la posibilidad de que algunos de estos animales, convertidos en focos  de infección, propaguen la enfermedad a animales domésticos susceptibles 7/8/9.

En diversos países se ha determinado la presencia de anticuerpos y se han aislado brucelas en animales silvestres, lo que hace que estas especies se constituyan en reservorio de la enfermedad 13/18/14/10/12/11. En consecuencia, resulta interesante estudiar la enfermedad en chigüires, ya que representan una especie ampliamente difundida en Venezuela, donde conviven con bovinos y búfalos,
especies estas de indiscutible interés económico en el país.

Este estudio, realizado en 1979, tuvo como objeto muestrear bazo, hígado, ganglios mesentéricos y retrofaríngeos de chigüires, con el propósito de aislar Brucella , y obtener información epizootiológica sobre esta enfermedad en chigüires de los Llanos de Venezuela.


MATERIALES Y METODOS

Se estudiaron 376 muestras de bazo, hígado, ganglios mesentéricos y retrofaríngeos de chigüires (Hydrochoerns hydrochaeris), 49 machos y 45 hembras, los cuales fueron sacrificados en el Hato Las Trincheras, Distrito Páez del Estado Apure, mediante la utilización de rifle.

EXÁMENES BACTERIOLÓGICOS

Los tejidos tomados para intentos de aislamiento de Brucella se procesaron de la siguiente forma: Se lavaron en solución al 0,85% de NaCl y se sembraron en medios de cultivos sólidos adicionados con un 5 % de suero fetal bovino (GIBCO). Los medios de cultivo utilizados fueron Triptosa, Albimi y Kuzdas Morse distribuidos en placa de Petri.

CULTIVO DE LAS MUESTRAS

Las muestras fueron incubadas a 37°C con una atmósfera de CO2 al 10 %, durante 9 días, con revisiones a partir de las 48 horas de sembradas.

IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS

La morfología de las colonias fue observada en el microscopio estereoscópico  según el método de HENRY (1933). Se consideraron como posibles brucelas todas las colonias observadas con características similares al género Brucella. Se practicó la tinción de Gram (1884) a todas las colonias sospechosas a Brucella.

SELECCIÓN DE COLONIAS

Todas aquellas colonias representativas del género Brucella se sembraron en placas de Petri y posteriormente se repicaron en tubos de ensayo con agar inclinado; se incubaron a 37°C con y sin CO2; con y sin suero.

PRUEBA DE ACRIFLAVINA.

Se utilizó una solución Acuosa 1: 1000 de acriflavina; se tomó una pequeña muestra del cultivo en estudio, colocándola en un porta-objeto donde se emulsionó a fin de observar si se producía o no aglutinación.

PRUEBAS DE INUNDACIÓN CON CRISTAL VIOLETA

Se utilizó una solución madre de Cristal Violeta a partir de la cual se preparó una dilución de 1:40 en agua destilada; se tomaron 5 mI de esta solución para cubrir una siembra en placa de Petri, durante 30 segundos, con el fin de observar si las colonias en estudio tenían características lisas o rugosas. 

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Prueba de la Ureasa Se utilizó la técnica de STUART (1945) para determinar si los organismos aislados tenían o no la capacidad de hidrolizar la urea, tomando amoníaco por acción de la enzima ureasa, lo cual, en caso de positividad, se hace evidente por la aparición de "Un color rosa violáceo.

Prueba de Producción de Ácido Sulfídrica (H2S) Se utilizó la prueba de la tira de papel de filtro con Acetato de Plomo (Laboratorio Merck); en tubo de ensayo con medio de cultivo de agar triptosa, sembrando con la cepa aislada, se colocó el papel de filtro y se sometió a incubación durante 5 días, con cambios del papel cada 24 horas, para observar el posible ennegrecimiento del papel, lo cual indicaba que la bacteria en estudio liberaba H2S por acción enzimática sobre los aminoácidos que contienen azufre.

Prueba de sensibilidad a diferentes colorantes y reactivos. Con el propósito de biotipificar las trece cepas aisladas se utilizaron los siguientes colorantes y re activos los cuales se adicionaron al medio de cultivo Agar Albimi en las siguientes diluciones: Fucsina Básica Tionina, 1:25000, 1:50000, 1:100 000; Violeta de Metilo, 1: 100000; Safranina, 1: 5000; Verde de Malaquita, 1: 500000. Todos los colorantes se esterilizaron a 100°C durante 1 hora. Eritritol, 1 mg por  mI de medio de cultivo;Penicliina; 5 UI por ml de medio de cultivo, ambos fueron utilizados por filtración (HUDDLESON15; RODE et al. 4).

Los medios de cultivos así preparados se repartieron en placas de Petri; posteriormente se sembraron con suspensiones bacterianas preparadas en solución al 0,85% de NaCI estéril, manteniendo una  densidad sensiblemente igual, tanto de las cepas en estudio como en las cepas de referencia (544-2E. abortus, 16 M B. melitensis y 1330 B. suis) y se incubaron a 37°C durante 72 horas con 10%.
de CO2.

Al observar el crecimiento bacteriano se hicieron comparaciones de la cepa en estudio con respecto a la cepa de referencia, en los diferentes colorantes y diluciones con el fin de determinar la especie y biotipo de la cepa en estudio.

Prueba de aglutinación con sueros monoespecificos. Se utilizaron los sueros Anti-A y Anti-M. Se prepararon suspensiones bacterianas con NaCI al 0,85 % y como cepas controles las 544-2 y 16 M. Se hicieron mezclas en un portaobjeto a fin de observar si se producía o no aglutinación perceptible en un minuto.

Prueba de sensibilidad al Fago Tbilisi (Tb). Se emplearon concentraciones del Fago Tb la DHP (dosis habitual de prueba) y una suspensión de 104 x DHP. Esta prueba se realizó con el fin de determinar la norma lítica que siguen diversas especies de Brucella. Las técnicas y procedimientos empleados son los descritos por ALTON et al.1.

CUADRO 1.- CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS TINTOREALES y BIOQUÍMICAS DE LAS 13 CEPAS AISLADAS DE CHIGUIRES IDENTIFICADAS COMO Brucella.

Características coloniales: a) Colonias pequeñas translúcidas.
b) Crecimiento lento.
C) No Aglutinadas por Acriflavina 1:1000
D) No se tiñeron con cristal violeta
Morfología Bacteriana: Cocobacilos.
Tinción Bacteriana: Gram negativo (color rosa)
Prueba de Ureasa: Negativa
Prueba de motilidad: Negativa

 

CUADRO 3.- RELACIÓN ENTRE LA EDAD DE LOS CHIGUIRES
y LOS AISLAMIENTOS DE Brucella. Distribución por edad de loS chigüires en relación al número de aislamientos de Brucella.

EDAD Aislamiento/Total (%)
1 - 10   Meses 0/2 (0)
11 - 20 Meses  9/48 (0,18)
21 - 30 Meses 3/22 (13,6)
31 - 40 Meses 0/7 (0)
41 - 50 Meses 1/13 (7,7)
51 - 60 Meses 0/2 (0)


ESTIMACIÓN DE LA EDAD DE LOS CHIGUIRES

Con este propósito se extrajeron los ojos de cada animal utilizándose la técnica del cristalino. (LORD16; LORD 17).


RESULTADOS

CARACTERÍSTICAS DE LOS AISLAMIENTOS

Las 13 cepas bacterianas aisladas a partir de órganos de chigüires, que se identificaron como Brucella se sometieron a diversas pruebas tendentes a evaluar características coloniales, morfología bacteriana, propiedades bioquímicas, sensibilidad a la presencia de colorantes, sensibilidad al efecto del Fago Tb y aglutinación con sueros monoespecíficos. Los resultados de estos análisis se presentan en los Cuadros 1 y 2.

Los resultados que se presentan en el Cuadro 2 muestra los requerimientos de CO2 y suero, así como el comportamiento de las cepas en estudio ante la presencia de diferentes diluciones de colorantes, producción de H2S, producción de Ureasa, reacción con sueros monoespecíficos y sensibilidad a fagos; en base a esas características se identificaron trece cepas como pertenecientes al género Brucella (Figuras 1 y 2). En base al comportamiento bioquímico y serológico se observó que seis de ellas correspondían a B. abortus Biotipo 1; las siete restantes presentaban resultados conflictivos que impedían su interpretación definitiva ya que no se ajustaban a las características de las especies de brucelas clásicas.


ESTUDIO EPIZOOTIOLOGICO

Con el propósito de establecer una posible correlación entre la edad de los chigüires y el aislamiento de brucelas, se aplicó la técnica del cristalino mediante la cual se pudo determinar que entre la población examinada se incluyeron animales de 8 hasta 60 meses de edad.

En el Cuadro 3 se describen los aislamientos en relación a la edad de los animales infectados. No se aisló bacteria en animales menores de 11 meses, ni en animales con edades comprendidas entre 31 y 40 meses, así como entre 51 y 60 meses. El mayor porcentaje de aislamientos ocurrió en chigüires entre 11 y 20 meses de edad.


DISCUSIÓN

Al analizar los resultados obtenidos con el fin de conocer la tasa de infección en los chigüires y su significancia en la cadena de transmisión de la brucelosis, se observó lo siguiente: de los 94 animales muestreados, en los 49 machos la tasa de aislamiento fue de un 10,62 %, mientras que en las hembras resultó en un 3,19 %.

Es importante señalar que de las trece cepas aisladas seis fueron tipificadas como B. abortus Biotipo I, pero es evidente que se hace necesario probar nuevamente todas las cepas utilizando otra técnica de biotipificación más sensible como metabolismo oxidativo, que permita definir con exactitud el biotipo de las cepas que por presentar resultados conflictivos no se pudieron tipificar (MEYER y MORGAN 19. Se conoce que el género Brucella es ureasa positivo, pero también conocemos que existen cepas atípicas sin actividad ureásica como es el caso de la cepa de referencia 544-2 B. abortus (PACHECO y THIAGO DE MELLO 23; SANDERS y WARNER 25), lo cual hace pensar que corresponden a biotipos diferentes de las cepas de referencia utilizadas. Tomando en cuenta que la especie estudiada corresponde a animales silvestres, pudiera ser que se trate de cepas taxonómicamente diferentes a las ya conocidas (MEYER 20; MOREIRA-JACOB 21).

Fig. 1: Prueba de sensibilidad a colorantes Fig. 2: Prueba de sensibilidad al fago Tbilisi.

Fig. 1: Prueba de sensibilidad a colorantes.

Fig. 2: Prueba de sensibilidad al fago Tbilisi.


Especialmente importante resultó la estimación de la edad en los chigüires mediante la técnica del Cristalino, considerada por OjASTI 22 Como una de las más sensibles técnicas disponible. En este sentido, cuando se comparan los datos obtenidos de la edad con los resultados bacteriológicos, la información revela que los chigüires se infectan con Brucella cuando Son jóvenes, observándose que la más alta tasa de aislamiento (18,8%) se encuentra en los chigüires con edades comprendidas entre 11 y 20 meses. Lo anteriormente expuesto sugiere que el chigüire juega un papel importante en la transmisión de la brucelosis con repercusiones epizootiológicas de consideración.


SUMMARY

In 1979 a study was made of capybara (Hydrochoeros hydrochaeris) from Las Trincheras Ranch, State of Apure, Venezuela, for the purpose of attempting to isolate Brucella spp. A total of 94 capybaras were necropsied and 376 samples of spleen, liver and mesenteric and retropharyngeal lymph nodes were examined.

Ten strains of Brucella were isolated from 49 males and three strains were isolated from 45 females. A1I strains were submitted to the stain sensitivity test, but only s ix strains could be tiped as B. abortus Biotype I. Likewise the distribution of the Brucella isolations was determined in relation to the age of the animals as estimated by the lens technique. The highest proportion of infection (18,8%) suggest that this rodent can be considered of importance in the trasmission of brucellosis when living near domestic animals.


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