Veterinaria Tropical 8: 95-111. 1983

CAMPYLOBACTERIOSIS (VIBRIOSIS) EN REBAÑOS 
BUFALINOS DE VENEZUELA¹

Gloria de Serrano*, Manuel Vargas Días* y Antonia clavijo*

¹Trabajo presentado el  IX congreso 
panamericano de medicina Veterinaria y Zootecnia
Marzo 1983. Maracay. Venezuela

* FONAIAP Centro Nacional de Investigaciones Veterinarias
Apdo. 70. Maracay 2102. Venezuela

Recibido: Agosto 1984

RESUMEN

Se examinaron 50 sementales bufalinos que se encontraban en servicio en explotaciones ubicadas en los Estados Monagas y Apure, empleando la técnica del lavado prepucial para la toma de las muestras, las cuales fueron procesadas aplicando la técnica de inmunofluorescencia directa, utilizando dos conjugados, uno elaborado en el Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP) , a partir de una cepa de campo de Campylobacter fetus. sub. esp fetus y otra importada de USA. De estas muestras, 23 fueron positivas a Campylobacter fetus. sub. esp fetus con ambos conjugados. No se observó ninguna reacción cruzada. Por cultivo bacteriológico se obtuvieron 26 cepas de género Campylobacter, habiendo sido clasificadas mediante pruebas bioquímicas: 23 de Campylobacter fetus. sub. esp fetus  y 2 de Campylobacter fetus. sub. esp .intestinalis Estos resultados coincidieron con los obtenidos por inmunofluorescencia directa. La prevalencia en la totalidad de los sementales bufalinos examinados fue del 50%. Los sementales muestreados fueron clasificados por grupos etarios, habiéndose encontrado que los búfalos, con edades comprendidas entre 2 a 4 años, presentaron un porcentaje de Positividad de 66,7%, los de 5 a 7 años de 31,6%, y los de 8 a l0 anos de 25%. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas (P ≤ 0,05).

INTRODUCCIÓN

La campylobacteriosis es una enfermedad que limita la producción y productividad ganadera, generando grandes pérdidas económicas representadas por un menor número de becerros por año, menor número de partos durante la vida útil de la vaca, intervalos entre partos prolongados así como una mayor utilización de los sementales o de semen congelado, debido a estados de infertilidad temporal (20,12,21) .

Es una enfermedad de naturaleza enzoótica que afecta el tracto genital de los bovinos, cuyo agente etiológico es el Campylobacter fetus. sub. esp fetus  Es transmitida en el momento del coito o de la inseminación artificial cuando se usa semen inadecuadamente manejado o tratado (25,6) .

En las hembras infectadas, el microorganismo se localiza en la vagina, cuello uterino, útero y oviductos (26). Pueden producir endometritis y algunas veces salpingitis (6,25,19,4,3).

Esta enfermedad se caracteriza por infertilidad y mayor número de servicios por concepción, acompañados por ciclos estrales prolongados y muerte embrionaria temprana. A veces se observan abortos tardíos, desde los 4 meses de preñez hasta el término de la gestación, complicándose en algunos casos con retención de secundinas (19,8,1,18), todo lo cual trae como consecuencia intervalos entre partos prolongados.

Las hembras infectadas con Campylobacter fetus. sub. esp fetus  desarrollan cierta resistencia a la enfermedad, quedando fértiles después de la infección, pero permanecen como portadoras del microorganismo. Después de cierto tiempo estas hembras se vuelven nuevamente susceptibles a la reinfección, aún cuando existan anticuerpos específicos en el moco vaginal (26).
 
Los machos son reservorios naturales para el Campylobacter fetus. sub. esp fetus  sin que en ellos se manifieste su presencia por algún signo clínico. El microorganismo vive como un saprofito en las partes más profundas del prepucio y alrededor del glande, pero no se produce ninguna anomalía funcional o estructural en sus órganos genitales (23, 29). Los sementales más viejos siguen infectados en forma crónica o permanente, a no ser que se les aísle y trate.

En los jóvenes la infección puede ser transitoria (1, 18); la susceptibilidad es menor en los toros jóvenes que en aquellos de 5 años o mayores (30) .

Son escasas las investigaciones publicadas sobre campylobacteriosis en la especie bufalina a nivel mundial, encontrándose trabajos aislados entre los cuales pueden citarse el de MOHAN (10) quien estudió por primera vez en la India la infección por Vibrio fetus presente en 7 búfalas, mediante el examen del moco vaginal. La mayor parte de ellas no concibió después de dos o más servicios y solamente en una búfala se produjo una marcada aglutinación.

MIRNESIRE (11) hizo referencia a la susceptibilidad de los búfalos a la vibriosis, siendo corroborado posteriormente por ROSS (17). LANCASTER (17) encontró Vibrio fetus presente en un búfalo de Malaya y RAO (16) detectó en 150 vacas y búfalas una aglutinación positiva en el moco vaginal de 11 búfalas y 10 vacas.

PRASAD y MALIK (14) aislaron el Vibrio fetus en 3 de 300 hembras bufalinas examinadas. Al ano siguiente PRASAD (15) reseña el aislamiento de 3 cepas de Vibrio fetus del tracto genital de hembras bufalinas.

Las primeras investigaciones sobre campylobacteriosis en búfalos (Bubalis bubalis ) en Venezuela fueron realizadas en el laboratorio de Patología de la Reproducción del Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP) en Maracay, Estado Aragua, a partir de 1980, comenzando en la Isla de Guara (Estado Monagas) y luego continuaron en 1981 y 1982 en los Centros de Recría Las Araguatas y Mantecal (Estado Apure).

El objetivo fundamental de este trabajo fue el de aislar e identificar cepas de Campylobacter tanto patógenas como apatógenas y determinar la prevalencia de campylobacteriosis en los sementales bufalinos en servicio en las explotaciones estudiadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Debido a que el macho constituye un indicador fiel de la existencia de la campylobacteriosis en un rebano, en el Laboratorio del Instituto de Investigaciones Veterinarias (IIV) se trabajó exclusivamente con sementales que se encontraban en servicio. Fueron muestreados 50 búfalos de raza Murrah ubicados en la Isla de Guara, Distrito Sotillo del Estado Monagas, en el Centro de Recría Las Araguatas, Municipio Biruaca, Distrito San Fernando, Estado Apure y en el Centro de Recría de Mantecal, Distrito Muñoz, zona de los módulos hidrológicos en el Estado Apure.

Estos animales son explotados en forma extensiva y su alimentación es a base de forrajes tales como gamelotillo (Paspalum plicatulum) , pangola (Digitaria decumbens) , lambedora ( Leersia hexandra) y paja de agua (Hymenachne amplexicaulis) 

Como primer paso de la investigación se procedió a depilar, lavar y secar el orificio prepucial de cada uno de los animales de la muestra seguidamente se provocó la micción mediante masajes en el prepucio. Se introdujeron 30cc de solución buffer, pH 7,2 estéril, contenida en frasco ámbar, utilizando sonda y embudo. Luego se cerró manualmente el orificio prepucial, dejando la sonda y dando masajes vigorosos por espacio de 15 minutos, para extraer los microorganismos alojados en el epitelio de la mucosa prepucial y glande. Se extrajo la muestra y se depositó en el mismo frasco ámbar, debidamente identificado.

Las muestras fueron procesadas a nivel de campo, para lo cual se utilizó un laboratorio ambulante bien equipado. Se tomaron 15 ml de cada muestra y fueron centrifugados a 2.500 rpm durante 10 minutos. Del sobrenadante se extrajeron 2,5 ml con jeringa, sembrándose 3 a 4 gotas en el medio de transporte (tioglicolato) , previo pasaje por filtro millipore de 0,65 (2, 27) .

Los cultivos fueron puestos en jarra de desecación, en estufa a 37 °C  y transportados al Laboratorio del IIV, donde permanecieron en incubación durante 3 a 5 días en atmósfera compuesta por 85% de nitrógeno, 10% de CO₂ y 5% de oxígeno (5,13). Luego se procedió al examen utilizando microscopio binocular de contraste de fase Carl Zeiss, con objetivo PHV 40x, para la observación de los Campylobacter, los cuales fueron identificados por su morfología, bacilos en forma de espiral, tirabuzón, por su movilidad rápida como flecha, de rebote, etc.    
 
Una vez realizado el examen microscópico se tomaron los cultivos con las características de Campylobacter para realizar la microscopía de fluorescencia, que tiene la función de comprobar un antígeno con la ayuda de un anticuerpo tratado con fluorocromo, permitiendo descubrir simultáneamente las inmunorreacciones en el objeto biológico (24) .Se aplicó la coloración directa que consiste en cubrir el frotis con una cepa de antisuero fluorocromado, formándose un complejo antígeno-anticuerpo-fluorescente. Se realizó la observación microscópica utilizando microscopio Leitz, modelo HM LUX con equipo de epifluorescencia, lámpara HBO-50 W/AC, objetivos 40 y 100 x.

Después de tomada la muestra para inmunofluorescencia, se procedió a la purificación de las cepas mediante el filtrado del cultivo con papel de filtro whatman de 9,0 cm y filtros millipore de 0,65.

Se efectuó la siembra en los diferentes medios de cultivo sólidos, brain heart infusión agar, adicionando 10% de sangre desfibrinada de bovino y antibióticos (bacitracina, sulfato de poliximina B, novobiocina) y fungicidas (Actidione, Nistatina) , medio agar brucella (Albimi) con 5% de suero de bovino (22, 28).

La siembra en los medios sólidos se efectuó colocando 3 a 4 gotas del filtrado en la superficie de los medios, usando para su dispersión asa de platino. Las placas fueron llevadas a estufa a 37 o C en atmósfera para microaerófilos. Al tercer día de incubación se hizo la primera revisión de placas, la cual podría prolongarse hasta el décimo o duodécimo día.

Las colonias que tenían de 1 a 3 mm de diámetro, redondas, lisas, enteras, convexas, traslúcidas, butirosas, no hemolíticas, eran separadas y sembradas en medio líquido (tioglicolato) e incubadas por 3 días a 37 °C en atmósfera de 85% de nitrógeno, 5% de oxígeno y 10% de CO₂.

Los cultivos puros fueron utilizados para efectuar la clasificación definitiva, mediante la coloración de Gram y las siguientes pruebas bioquímicas:

1.- La producción de catalasa, utilizando peróxido de hidrógeno al 3%.

2.- Producción de hidrógeno sulfurado (prueba de sensibilidad) , utilizando cisteína al 0,02% y una tira de papel de filtro impregnada en acetato de plomo y la prueba no sensible con el medio SIM (sulfide indole motility).

3.- Tolerancia a la glicina al 1%. 4.- Tolerancia al cloruro .de sodio al 3,5% y 4,5%.

5.- Tolerancia al calor (42 °C) .

Para efectuar estas pruebas se utilizaron dos medios bases, el "A" compuesto de caldo brucella, extracto de levadura, agar y agua bidestilada y el medio "B" tioglicolato, compuesto de bacto-casitone, extracto de levadura, dextrosa, cloruro de sodio, L-Cisteína, tioglicolato de sodio, agar y rezazurina.

Las pruebas bioquímicas se realizaron por duplicado y se examinaron a los 3-5 días en microscopio de contraste de fase con objetivo de 40x.

En la realización de este trabajo se tomó en cuenta la edad de los sementales muestreados, clasificándolos en grupos etarios. Se hizo análisis estadístico mediante la prueba de Ji cuadrado, utilizando el procedimiento "Crosstabs" del sistema SPSS-ll para el DEC-PDP-ll, del Centro de Computación del CENIAP (FONAIAP).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De los cultivos, 26 que tenían características de Campylobacter fueron procesados mediante la técnica de inmunofluorescencia, habiendo resultado 23 positivos a Campylobacter fetus sub. esp. fetus y 3 negativos.

Se emplearon 2 conjugados, uno elaborado en el IIV, a partir de unas cepas de campo de Campylobacter fetus sub. esp. fetus (Nacional) y otro donado por Plum Island Disease Center (USA). Los resultados obtenidos con ambos conjugados fueron similares (Cuadro 1).

Utilizando el método bacteriológico, se aislaron 26 cepas pertenecientes al género Campylobacter, las cuales fueron clasificadas por pruebas bioquímicas en 25 cepas patógenas, 23 cepas de Campylobacter fetus sub. esp. fetus 2 de Campylobacter fetus sub. esp. lntestinalis y una cepa apatógena de  Campylobacter sputorum sub. esp. sputorum (Cuadro 2).

Se compararon los diagnósticos por inmunofluorescencia directa y por cultivo bacteriológico (Cuadro 3) , coincidiendo los resultados obtenidos por ambos métodos cuando se trataba de  Campylobacter fetus sub. esp. fetus, mientras que estos fueron diferentes en presencia de otras especies y subespecies de Campylobacter, lo cual concuerda con las observaciones de WINTER y col. (30), quienes señalaron que la combinación de ambos métodos constituye el procedimiento ideal para el diagnóstico de la Campylobacteriosis.

Los sementales bufalinos muestreados fueron clasificados por grupos etarios (2-4, 5-7 y 8-10 años) (Cuadro 4) , habiéndose encontrado que los búfalos con edades comprendidas entre 2 a 4 años presentaron un porcentaje de positividad de 66,7%, los de 5 a 7 años de 31,6% y los de 8 a 10 años de 25%. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas (P ≤ 0,05 X² 6,57; X ² grados de libertad).

Estos resultados, a pesar de que no se trata de la misma especie, difieren de los obtenidos en bovinos por diversos autores, entre ellos SAMUELSON y col. (23), quienes observaron que los toros con edades comprendidas entre 4 y 10 anos son más propensos a contraer la infección, debido a la mayor profundidad de las criptas de la mucosa prepucial, que permiten mantener un ambiente microarófilo que favorece al Campylobacter, el cual es muy sensible a la presencia del oxígeno.

De los 50 sementales bufalinos muestreados, 25 fueron positivos a Campylobacteriosis, con una prevalencia del 50% (Cuadro 4).

SUMMARY

Fifty preputial fluid samples from breeding buffalo sires were taken in several herds located in Venezuela's Monagas and Apure States, in order to isolate and identify Campylobacter fetus  organisms. Samples were analized using the direct inmunofluorescence technique. Two conjugates were used: the first one was produced in the Veterinary Research Institute in Venezuela from a country strain of C.  fetus  sub sp  fetus  and second one was imported from USA. Results of laboratory diagnoses indicated twenty three positive samples to C.  fetus  sup sp. fetus  with both conjugates. Crossed reactions were not observed. By means or bacteriological cultures were detected and identified twenty six strains of Campylobacter genus. These strains were clasified according to biochemical tests in twenty three C. fetus sub. sp. fetus , two C.  fetus  sub. sp. intestinalis and one C. sputorum sub. sp. sputorum. These results were coincident with those obtained using inmunofluorescence technique. Campylobacteriosis prevalence was estimated in fifty percent these buffalo sires. According to group age classification the incidence founded on buffaloes within two to four years was 66,7%1 from five to seven years was 31,6%  and from  eight to  ten  years was 25%. These differences were  statistically significant (P ≤ 0,05) . 

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