Veterinaria Tropical 8: 37-56. 1983 Hermann Wiedenhofer* * FONAIAP |
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RESUMEN Se presenta una metodolog�a no param�trica de "curvas de crecimiento" para la evaluaci�n cuantitativa de la efectividad de vacunas de uso veterinario. Los c�lculos son relativamente sencillos, se utilizan los datos transferidos en "rangos de orden". Se compara la "curva de crecimiento" de los animales vacunados con la correspondiente de los testigos. Esta metodolog�a es �til cuando en la evaluaci�n se utilizan variables cuantitativas de naturaleza humoral, tisular o de otro tipo, que est�n sujetas a ser medidas a lo largo del tiempo (longitudinalmente). Se discute y resuelve un ejemplo num�rico. INTRODUCCI�N En la evaluaci�n de la efectividad de vacunas de uso veterinario pueden utilizarse, seg�n sea el caso, variables cualitativas o cuantitativas. Variables cualitativas podr�an ser por ejemplo "enferma" o "no enferma", "muere" o "sobreviven, "presenta ciertas caracter�sticas" o "no las presentan, etc, y como variables cuantitativas se pueden utilizar la temperatura corporal, valores tisulares, sangu�neos o de la orina, etc. En ambos casos las variables se comparan en dos grupos de animales, uno "vacunado" y el otro "no vacunado" o "control". Los dos grupos se exponen al agente nosol�gico (confrontaci�n) , contra quien se elabora la vacuna. Se espera que los " controles " enfermen y que los vacunados no lo hagan. Frecuentemente "enfermar" no est� bien definido, o si lo est� no es f�cil de medir. Es por esto que debe tomarse como punto de referencia, en el caso cuantitativo, a alg�n valor humoral o tisular que est� relacionado con la enfermedad en cuesti�n. En un estudio efectuado por SCHROEDER y col. (4) , para determinar la efectividad de una "vacuna" contra la anaplasmosis, el autor del presente trabajo sugiri� utilizar una variable a la cual denomin� "Descenso porcentual del valor de hematrocito". Se trataba de la diferencia entre el promedio de los valores de hematrocito de un animal dado, sobre los d�as pre-experimentales y el valor m�nimo de hematrocito despu�s de la confrontaci�n, dividido por el promedio indicado y multiplicado por 100. Para ese momento no se contaba con una variable "mejor", para ser utilizada en pruebas univariadas param�tricas, tal como la prueba "t de Student". El defecto de esta variable consist�a principalmente en que "desperdiciaba" datos valiosos que se recopilaban a trav�s del tiempo en el per�odo pre-experimental, en el de la vacunaci�n y en el de la confrontaci�n. Es as� que si dos animales ten�an un promedio pre-experimental de hematrocito igual, as� como la m�nima despu�s de exposici�n, se les pod�a considerar como iguales con respecto a la respuesta en estudio. Sin embargo, un animal pudiera llegar a la m�nima en un per�odo corto de tiempo y luego recuperarse en un per�odo largo, mientras que otro animal pudiera hacerlo a la inversa, indicando que �ste �ltimo est� mejor protegido que el primero. Basado en esta idea se determin� la necesidad del uso de un m�todo multivariado que utilizara la "curva" completa de los valores de inter�s a trav�s del tiempo. Estos m�todos se conocen hoy d�a como "M�todos de curvas de crecimiento". METODOLOG�A El enfoque del problema como curva de crecimiento, para ser analizado como tal, no se pudo utilizar por dos razones: a) las variables de respuestas no siempre pueden medirse en escala de intervalo o de raz�n, y b) las curvas que se obtienen no son mon�tonas crecientes. Afortunadamente, KOZIOL y col. (2) , en un estudio de inmunoterapia de tumores de ratones, describe una metodolog�a no param�trica para curvas de crecimiento, que no es otra cosa que la generalizaci�n multivariada de la prueba no param�trica de KRUSKAL-WALLIS, utilizando la variable tiempo, descrita anteriormente por HORRELL y LESSING (I) . Se trata de rechazar la hip�tesis nula de que la distribuci�n acumulativa multivariada del grupo control es igual a la del grupo vacunado: Ho: Fc= Fv. La hip�tesis alterna puede ser de una o dos colas: en el caso que se desee probar la igualdad de las distribuciones en el per�odo pre-experimental, se utilizar� la hip�tesis alterna de dos colas: HA: Fct ≠ Fv. Si se desea determinar alg�n efecto patog�nico de la vacuna se utilizar� la hip�tesis de una cola: HA: F c > F v � F c < F v seg�n haya aumento o disminuci�n de los valores de la variable. Lo anterior tambi�n es v�lido para el per�odo post-confrontaci�n, donde realmente se prueba la efectividad de la vacuna.
PROCEDIMIENTO El procedimiento ser� descrito con un ejemplo basado en datos reales, pero modificados, con el objeto de facilitar la ilustraci�n. Lo m�s importante del caso es seleccionar una variable, que sea la m�s adecuada para la enfermedad en cuesti�n. La variable debe estudiarse para estandarizar la metodolog�a de la recolecci�n de los datos, especialmente en lo referente al an�lisis, manejo de los animales, hora (s) del d�a en que deben muestrearse, etc. Se debe establecer de antemano cu�les son los valores y el rango dentro del cual pueden moverse los valores anormales. El ejemplo trata de la prueba de una "vacuna" contra el Anaplasma. No se entrar� en detalles, pero s� se indicar�n algunos procedimientos generales y valores de la variable en estudio. La variable ser� "Hemoglobina" en gramos por 100 mI de sangre. Se consideran como valores normales los que oscilan entre 9 y 15 g/100 ml. Se considera a un animal "enfermo" de anaplasmosis cuando la hemoglobina baja de 5, previa comprobaci�n de causa. Se tienen 12 novillos, los cuales se asignan al azar a uno de los dos tratamientos (grupos): grupo control y grupo vacunado. Durante el per�odo pre-vacunal se les toma muestras de sangre en d�as determinados y se anota el contenido de hemoglobina. El n�mero de d�as y el intervalo entre ellos no tiene que ser alguno en especial, siempre y cuando sea el mayor n�mero posible y que todos los animales se muestren el mismo d�a y aproximadamente a la misma hora. En el Cuadro 1 se muestran los valores de hemoglobina para 5 ocasiones igualmente espaciadas (aunque no sea necesario el espaciado igual) . Obtenidos los valores de hemoglobina, para cada d�a en particular, se procede a ordenarlos de menor a mayor. Luego se sustituyen los valores de hemoglobina por los valores de sus rangos (orden) , tal como se describe en el Cuadro 2. Se calcula, para cada d�a, el rango promedio de control y grupo "vacunado" (no ha sido vacunado todav�a) .Estos valores se describen en el Cuadro10 como R'tc. y R'tv. respectivamente. Se obtienen tal como lo indica la f�rmula 5. Estos valores son importantes ya que nos dan un resumen por d�a de la situaci�n. Para 12 animales el rango medio general es de 6,5. Se observa que el grupo control tiene 3 valores por encima de 6,5, mientras que el vacunado tiene s�lo 2. Sin embargo, los valores no se alejan demasiado de 6,5, salvo 7,44.
A simple vista se aprecia que el grupo experimental (control y vacunados) fue asignado en forma aleatoria en lo que respecta a contenido de hemoglobina hem�tica. Pero esto �ltimo se desea comprobar estad�sticamente, para lo cual se efect�a una prueba de hip�tesis de igualdad de distribuciones acumulativas. Se calcula el estad�stico de prueba LN tal como se indica en las formulas1 al 9, obteni�ndose los valores intermedios indicados en el Cuadro 3. Se obtiene LN = 5,416 con p = 0,367 > 0,05. No se rechaza la hip�tesis nula y se concluye que los datos evidencian que no hay diferencia entre los dos grupos. Esta prueba, tal como se indic� con anterioridad, es de dos colas ya que no se pod�a predecir la direcci�n de los resultados. posteriormente el grupo "vacunado" se vacuna, mientras que el grupo control no. Despu�s de un cierto n�mero de d�as se observa a ambos grupos para comparar los valores de hemoglobina y determinar si hubo alg�n efecto patol�gico en el grupo vacunado. El Cuadro 4 se presentan los valores obtenidos. Se nota una baja de hemoglobina en los vacunados, pero sin llegar al valor 5 que se considera como indicador de la enfermedad. En el Cuadro 10 se aprecia que todos los valores de los rangos medios del grupo control se encuentran por encima de la media general 6,5, a excepci�n del �ltimo d�a que coincide con �l, y que todos los valores de los vacunados est�n por debajo de 6,5, a excepci�n del �ltimo que coincide con esta cifra. Se concluye entonces que hay cierta diferencia a favor de los controles.
Tal como se hizo anteriormente, se efect�a la prueba de hip�tesis siguiendo el procedimiento antes descrito, s�lo que ahora se efectuar� una prueba de una cola, ya que se espera que todos los valores para los controles sean mayores que los correspondientes a los vacunados.
En el Cuadro 5 se indican los rangos y en el Cuadro 6 los valores de los c�lculos intermedios. Se obtiene Ln= 9,861 con p= 0,079. Este valor es para una prueba de dos colas, por lo que hay que dividir por 2, as�: p= 0,0395 < 0,05. Se concluye que hay diferencia significativa entre el grupo control y el vacunado. Si bien hay una baja significativa de la hemoglobina en los vacunados, esto no indica que los animales enfermaron sino que hubo cierto efecto, patog�nico o no. La interpretaci�n corresponde al investigador y difiere para cada caso. Finalmente, para saber si la vacuna en realidad protege a los vacunados, se inocula a ambos grupos con el germen o agente nosol�gico. Se espera que todos los controles (no protegidos) enfermen y que ninguno de los vacunados (protegidos) lo hagan. Despu�s de confrontar los animales, se elige la fecha en la cual se empiezan a tomar en cuenta las observaciones para el an�lisis. En el presente caso se tom� como partida el momento en que todos los controles ten�an sus hemoglobinas en 5 o menos. Tambi�n debe elegirse la fecha o o�a en que deben terminarse las observaciones. Se tom� como �ltimo d�a aquel en el cual todos los controles ten�an sus hemoglobinas sobre 5. Las mencionadas
fechas o d�as son importantes ya que se considera como el per�odo
adecuado para el an�lisis. En cada tipo de vacuna deben establecerse
estas fechas.
En el Cuadro10 se observa que todos los valores de los rangos medios son de 2,5 en los controles, mientras que los de los vacunados son de 8,5. En los Cuadros 7 y 10 se nota que hubo diferencia entre los grupos a favor de los vacunados. Para Ln = 11,175 se obtiene un valor de p = 0,048. Como la prueba es de una cola: p= 0,024 < 0,05, 10 que indica que hubo diferencias entre ambos grupos. La conclusi�n es que la vacuna protege.
DISCUSI�N El m�todo cuantitativo para la evaluaci�n de la efectividad de vacunas es un m�todo adecuado y relativamente f�cil de ejecutar. Los c�lculos, tal como est�n presentados en el ejemplo son sencillos a excepci�n de la inversi�n de la matriz V.
En el ejemplo se utilizan cinco d�as de observaci�n para los c�lculos aunque se debe utilizar un mayor n�mero, sin olvidar las observaciones hechas para el per�odo post-confrontaci�n. Con 12 animales posiblemente no se obtengan diferencias significativas altas a menos que las diferencias sean verdaderamente dram�ticas, como es el caso del ejemplo expuesto. LN se distribuye aproximadamente como Ji al cuadrado y se le acercar� m�s a medida que sea mayor el grupo experimental. En general, se recomienda efectuar los c�lculos con una computadora aunque �sta no sea de gran capacidad. Una vez m�s se enfatiza el hecho de que debe estudiarse con detenimiento la variable determinante, los momentos y cantidades de muestras que deben entrar a formar parte del an�lisis. La metodolog�a debe quedar bien establecida antes de iniciar las pruebas. SUMMARY A nonparametric "growth curve" method for the evaluation of the effectiveness of vaccines for veterinary use is introduced. Calculations are relatively simple. The "growth curve" of rank transformed data from vaccinated animals are compared with the corresponding to the test animals. The method is usefull when the evaluation is based on the measurement of cuantitative body variables throughout the time (longitudinal) .A numerical example is worked. BIBLIOGRAF�A 1. HORRELL, J. F. and V. P. LESSIG. A note on a multivariate generalization of the Kruskal-Wallis test. Decisi�n Sciences 6: 135-141. 1975. 2.- KOZIOL, J. A., D. A. MAXWELL, M. FUKUSHI- MA, M. E. M. COLMERANER and Y. H. PILCH. A distribution-free test for tumor-growth analysis with application to an animal tumor inmunotherapy experiments. Biometrics 37: 383-390. 1981. 3.- PURI, M. L. and P. K. SEN. Nonparametric methods in multivariate analysis. New York. Wiley. 1971. 4.- SCHROEDER, W. F., C. E. LEON R., M. TORO BENITEZ, H. WIEDENHOFER and R. LOPEZ BOYER. Interference in premunition by anaplasma by a live modified Foot and mouth disease virus vaccine. In: Pathology of Parasitic Disease. Gaafar, s. M., Urquhart, G. M., Euzeby, J., Soulsby, E. J. L. Y Lammler, G. Purdue University Studies. Lafayette, Indiana, U.S.A. 1971.
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