Veterinaria Tropical 8: 37-56. 1983

* FONAIAP
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias
Aptdo. 4653. Maracay 2101. Venezuela

Recibido: Julio 26, 1985

RESUMEN 

Se presenta una metodología no paramétrica de "curvas de crecimiento" para la evaluación cuantitativa de la efectividad de vacunas de uso veterinario. Los cálculos son relativamente sencillos, se utilizan los datos transferidos en "rangos de orden". Se compara la "curva de crecimiento" de los animales vacunados con la correspondiente de los testigos. Esta metodología es útil cuando en la evaluación se utilizan variables cuantitativas de naturaleza humoral, tisular o de otro tipo, que estén sujetas a ser medidas a lo largo del tiempo (longitudinalmente). Se discute y resuelve un ejemplo numérico.

INTRODUCCIÓN 

En la evaluación de la efectividad de vacunas de uso veterinario pueden utilizarse, según sea el caso, variables cualitativas o cuantitativas. Variables cualitativas podrían ser por ejemplo "enferma" o "no enferma", "muere"  o  "sobreviven, "presenta ciertas características" o "no las presentan, etc, y como variables cuantitativas se pueden utilizar la temperatura corporal, valores tisulares, sanguíneos o de la orina, etc. En ambos casos las variables se comparan en dos grupos de animales, uno "vacunado" y el otro "no vacunado" o "control". Los dos grupos se exponen al agente nosológico (confrontación) , contra quien se elabora la vacuna. Se espera que los " controles " enfermen y que los vacunados no lo hagan.

Frecuentemente "enfermar" no está bien definido, o si lo está no es fácil de medir. Es por esto que debe tomarse como punto de referencia, en el caso cuantitativo, a algún valor humoral o tisular que esté relacionado con la enfermedad en cuestión.

En un estudio efectuado por SCHROEDER y col. (4) , para determinar la efectividad de una "vacuna" contra la anaplasmosis, el autor del presente trabajo sugirió utilizar una variable a la cual denominó "Descenso porcentual del valor de hematrocito". Se trataba de la diferencia entre el promedio de los valores de hematrocito de un animal dado, sobre los días pre-experimentales y el valor mínimo de hematrocito después de la confrontación, dividido por el promedio indicado y multiplicado por 100. Para ese momento no se contaba con una variable "mejor", para ser utilizada en pruebas univariadas paramétricas, tal como la  prueba "t de Student".

El defecto de esta variable consistía principalmente en que "desperdiciaba" datos valiosos que se recopilaban a través del tiempo en el período pre-experimental, en el de la vacunación y en el de la confrontación.

Es así que si dos animales tenían un promedio pre-experimental de hematrocito igual, así como la mínima después de exposición, se les podía considerar como iguales con respecto a la respuesta en estudio.

Sin embargo, un animal pudiera llegar a la mínima en un período corto de tiempo y luego recuperarse en un período largo, mientras que otro animal pudiera hacerlo a la inversa, indicando que éste último está mejor protegido que el primero. Basado en esta idea se determinó la necesidad del uso de un método multivariado que utilizara la "curva" completa de los valores de interés a través del tiempo. Estos métodos se conocen hoy día como "Métodos de curvas de crecimiento".

METODOLOGÍA

El enfoque del problema como curva de crecimiento, para ser analizado como tal, no se pudo utilizar por dos razones: a) las variables de respuestas no siempre pueden medirse en escala de intervalo o de razón, y b) las curvas que se obtienen no son monótonas crecientes. Afortunadamente, KOZIOL y col. (2) , en un estudio de inmunoterapia de tumores de ratones, describe una metodología no paramétrica para curvas de crecimiento, que no es otra cosa que la generalización multivariada de la prueba no paramétrica de KRUSKAL-WALLIS, utilizando la variable tiempo, descrita anteriormente por HORRELL y LESSING (I) .

Se trata de rechazar la hipótesis nula de que la distribución acumulativa multivariada del grupo control es igual a la del grupo vacunado: H_o: F_c= F_v.

La hipótesis alterna puede ser de una o dos colas: en el caso que se desee probar la igualdad de las distribuciones en el período pre-experimental, se utilizará la hipótesis alterna de dos colas: HA: Fct ≠ Fv.

Si se desea determinar algún efecto patogénico de la vacuna se utilizará la hipótesis de una cola:

HA: F c > F v ó F c < F v

según haya aumento  o disminución de los valores de la variable. Lo anterior también es válido para el período post-confrontación, donde realmente se prueba la efectividad de la vacuna.

En el Anexo 1 se indica el estadístico de prueba, así como los detalles de su construcción y distribución.

PROCEDIMIENTO

El procedimiento será descrito con un ejemplo basado en datos reales, pero modificados, con el objeto de facilitar la ilustración.

Lo más importante del caso es seleccionar una variable, que sea la más adecuada para la enfermedad en cuestión. La variable debe estudiarse para estandarizar la metodología de la recolección de los datos, especialmente en lo referente al análisis, manejo de los animales, hora (s) del día en que deben muestrearse, etc.

Se debe establecer de antemano cuáles son los valores y el rango dentro del cual pueden moverse los valores anormales.

El ejemplo trata de la prueba de una "vacuna" contra el Anaplasma. No se entrará en detalles, pero sí se indicarán algunos procedimientos generales y valores de la variable en estudio.

La variable será "Hemoglobina" en gramos por 100 mI de sangre. Se consideran como valores normales los que oscilan entre 9 y 15 g/100 ml. Se considera a un animal "enfermo" de anaplasmosis cuando la hemoglobina baja de 5, previa comprobación de causa.

Se tienen 12 novillos, los cuales se asignan al azar a uno de los dos tratamientos (grupos): grupo control y grupo vacunado.

Durante el período pre-vacunal se les toma muestras de sangre en días determinados y se anota el contenido de hemoglobina. El número de días y el intervalo entre ellos no tiene que ser alguno en especial, siempre y cuando sea el mayor número posible y que todos los animales se muestren el mismo día y aproximadamente a la misma hora.

En el Cuadro 1 se muestran los valores de hemoglobina para 5 ocasiones igualmente espaciadas (aunque no sea necesario el espaciado igual) .

Obtenidos los valores de hemoglobina, para cada día en particular, se procede a ordenarlos de menor a mayor. Luego se sustituyen los valores de hemoglobina por los valores de sus rangos (orden) , tal como se describe en el Cuadro 2.

Se calcula, para cada día, el rango promedio de control y grupo "vacunado" (no ha sido vacunado todavía) .Estos valores se describen en el Cuadro10 como R'_tc. y R'_tv. respectivamente. Se obtienen tal como lo indica la fórmula 5. Estos valores son importantes ya que nos dan un resumen por día de la situación. Para 12 animales el rango medio general es de 6,5. Se observa que el grupo control tiene 3 valores por encima de 6,5, mientras que el vacunado tiene sólo 2. Sin embargo, los valores no se alejan demasiado de 6,5, salvo 7,44.

A simple vista se aprecia que el grupo experimental (control y vacunados) fue asignado en forma aleatoria en lo que respecta a contenido de hemoglobina hemática. Pero esto último se desea comprobar estadísticamente, para lo cual se efectúa una prueba de hipótesis de igualdad de distribuciones acumulativas. Se calcula el estadístico de prueba L_N  tal como se indica en las formulas1 al 9,  obteniéndose los  valores  intermedios  indicados  en el  Cuadro 3.  Se obtiene L_N = 5,416  con   p = 0,367 > 0,05. 

No se rechaza la hipótesis nula y se concluye que los datos evidencian que no hay diferencia entre los dos grupos. 

Esta prueba, tal como se indicó con anterioridad, es de dos colas ya que no se podía predecir la dirección de los resultados. 

posteriormente el grupo "vacunado" se vacuna, mientras que el grupo control no. Después de un cierto número de días se observa a ambos grupos para comparar los valores de hemoglobina y determinar si hubo algún efecto patológico en el grupo vacunado. 

El Cuadro 4 se presentan los valores obtenidos. Se nota una baja de hemoglobina en los vacunados, pero sin llegar al valor 5 que se considera como indicador de la enfermedad. 

En el Cuadro 10 se aprecia que todos los valores de los rangos medios del grupo control se encuentran por encima de la media general 6,5, a excepción del último día que coincide con él, y que todos los valores de los vacunados están por debajo de 6,5, a excepción del último que coincide con esta cifra. Se concluye entonces que hay cierta diferencia a favor de los controles.

Tal como se hizo anteriormente, se efectúa la prueba de hipótesis siguiendo el procedimiento antes descrito, sólo que ahora se efectuará una prueba de una cola, ya que se espera que todos los valores para los controles sean mayores que los correspondientes a los vacunados.

En el Cuadro 5 se indican los rangos y en el Cuadro 6 los valores de los cálculos intermedios. Se obtiene Ln= 9,861 con p= 0,079. Este valor es para una prueba de dos colas, por lo que hay que dividir por 2, así: p= 0,0395 < 0,05. Se concluye que hay diferencia significativa entre el grupo control y el vacunado.

Si bien hay una baja significativa de la hemoglobina en los vacunados, esto no indica que los animales enfermaron sino que hubo cierto efecto, patogénico o no. La interpretación corresponde al investigador y difiere para cada caso.

Finalmente, para saber si la vacuna en realidad protege a los vacunados, se inocula a ambos grupos con el germen o agente nosológico. Se espera que todos los controles (no protegidos) enfermen y que ninguno de los vacunados (protegidos) lo hagan.

Después de confrontar los animales, se elige la fecha en la cual se empiezan a tomar en cuenta las observaciones para el análisis. En el presente caso se tomó como partida el momento en que todos los controles tenían sus hemoglobinas en 5 o menos. También debe elegirse la fecha o oía en que deben terminarse las observaciones. Se tomó como último día aquel en el cual todos los controles tenían sus hemoglobinas sobre 5.

Las mencionadas fechas o días son importantes ya que se considera como el período adecuado para el análisis. En cada tipo de vacuna deben establecerse estas fechas.

En el Cuadro 7 se presentan los valores de hemoglobina después de confrontar, en el Cuadro 8 los rangos y en el Cuadro 9 los cálculos intermedios.

En el Cuadro10 se observa que todos los valores de los rangos medios son de 2,5 en los controles, mientras que los de los vacunados son de 8,5.

En los Cuadros 7 y 10   se   nota que hubo diferencia entre los grupos a favor de los vacunados. Para Ln = 11,175 se obtiene un valor de p = 0,048. Como la prueba es de una cola: p= 0,024 < 0,05, 10 que indica que hubo diferencias entre ambos grupos. La conclusión es que la vacuna protege.

DISCUSIÓN

El método cuantitativo para la evaluación de la efectividad de vacunas es un método adecuado y relativamente fácil de ejecutar. Los cálculos, tal como están presentados en el ejemplo son sencillos a excepción de la inversión de la matriz V.

En el ejemplo se utilizan cinco días de observación para los cálculos aunque se debe utilizar un mayor número, sin olvidar las observaciones hechas para el período post-confrontación. 

Con 12 animales posiblemente no se obtengan diferencias significativas altas a menos que las diferencias sean verdaderamente dramáticas, como es el caso del ejemplo expuesto. L_N se distribuye aproximadamente como Ji al cuadrado y se le acercará más a medida que sea mayor el grupo experimental. 

En general, se recomienda efectuar los cálculos con una computadora aunque ésta no sea de gran capacidad. 

Una vez más se enfatiza el hecho de que debe estudiarse con detenimiento la variable determinante, los momentos y cantidades de muestras que deben entrar a formar parte del análisis. La metodología debe quedar bien establecida antes de iniciar las pruebas.

SUMMARY 

A nonparametric "growth curve" method for the evaluation of the effectiveness of vaccines for veterinary use is introduced. Calculations are relatively simple. The "growth curve" of rank transformed data from vaccinated animals are compared with the corresponding to the test animals. The method is usefull when the evaluation is based on the measurement of cuantitative body variables throughout the time (longitudinal) .A numerical example is worked.

BIBLIOGRAFÍA 

1. HORRELL, J. F. and V. P. LESSIG. A note on a multivariate generalization of the Kruskal-Wallis test. Decisión Sciences 6: 135-141. 1975.

 2.- KOZIOL, J. A., D. A. MAXWELL, M. FUKUSHI- MA, M. E. M. COLMERANER and Y. H. PILCH. A distribution-free test for tumor-growth analysis with application to an animal tumor inmunotherapy experiments. Biometrics 37: 383-390. 1981.

3.- PURI, M. L. and P. K. SEN. Nonparametric methods in multivariate analysis. New York. Wiley. 1971.

4.- SCHROEDER, W. F., C. E. LEON R., M. TORO BENITEZ, H. WIEDENHOFER and R. LOPEZ BOYER. Interference in premunition by anaplasma by a live modified Foot and mouth disease virus vaccine. In: Pathology of Parasitic Disease. Gaafar, s. M., Urquhart, G. M., Euzeby, J., Soulsby, E. J. L. Y Lammler, G. Purdue University Studies. Lafayette, Indiana, U.S.A. 1971.

Anexo 1