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Zootecnia Trop., 20(4):501-513. 2002 NOTA TÉCNICA Determinación de saxitoxina y sus derivados en moluscos bivalvos: Evaluación y optimización del uso de cromatografía líquida de alta resolución con previa oxidación Luisa Rojas de Astudillo [1], Iván Chang-Yen[2], Amelia La Barbera-Sánchez[3]
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RESUMEN La
saxitoxina y sus derivados son potentes neurotoxinas que originan
afecciones asociadas a la intoxicación paralizante en humanos (PSP,
siglas en inglés) que son producidas primariamente por dinoflagelados.
Con la finalidad de evaluar y optimizar el uso de la cromatografía líquida
de alta resolución con previa oxidación para la determinación de la
saxitoxina y sus derivados se tomaron muestras de mejillones verdes (Perna
viridis) y ostras (Crassostrea
sp) en seis localidades de Venezuela y cuatro de Trinidad, de éste último
a lo largo de la costa occidental, durante el mes de junio del 2000. Las
muestras fueron extraídas siguiendo el procedimiento AOAC usado para el
bioensayo de ratón. Cada extracto fue oxidado usando ácido peryódico y
el producto de oxidación inyectado a la columna cromatográfica. El método
utilizado para la cromatografía líquida de alta resolución con detector
de fluorescencia correspondió a una modificación del sugerido por
Lawrence et al. (1996). Se logró la separación de importantes pares de
toxinas (STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3), pero la resolución y la altura de los
picos de los productos de oxidación de esas toxinas variaron dependiendo
de la eficiencia de las columnas utilizadas. Algunas muestras presentaron
contaminación por PSP, pero las concentraciones estuvieron por debajo de
los límites permisibles, las cuales fueron confirmadas por el método de
bioensayo del ratón. Los resultados demuestran que el método de reacción
precolumna provee una información rápida acerca de la composición de
las toxinas, independiente de la matriz del organismo receptor y es un método
simplificado para el monitoreo de PSP en moluscos en el Caribe. Palabras
clave: Saxitoxina, PSP, neurotoxina, dinoflagelados, tóxicos.
La
acumulación de toxinas por moluscos como un resultado de la ingesta de
dinoflagelados tóxicos ha sido un gran riesgo para la salud pública y ha
causado grandes pérdidas a la industria de productos marinos. La más
conocida de todas las intoxicaciones es la intoxicación paralizante por
consumo de mariscos (PSP, siglas en inglés) causada por neurotoxinas que
son producidas primariamente por varias especies de dinoflagelados.
Eventos de PSP causados por dinoflagelados han sido registrados en
Venezuela desde hace 25 años y en Trinidad recientemente (Chang-Yen et
al., 1999; Ammons et al.,
2001; La Barbera-Sánchez y Estrella, 1996). Colectivamente esas toxinas
PSP son denominadas saxitoxinas derivando su nombre del Saxidomus
giganteus, en donde la saxitoxina fue originalmente extraída e
identificada (Bates y Rapoport, 1975).
Saxitoxina
es el primer compuesto marino cuyo origen se asoció al fitoplancton
(Shimizu, 1993). Existen aproximadamente 21 formas moleculares de esas
toxinas (Figura 1) que han sido aisladas de dinoflagelados tales como Alexandrium
spp., Gymnodinium catenatum, y Pyrodinium
bahamense var. compressum (Yasumoto et
al., 1995). Todas las saxitoxinas bloquean el movimiento del ión
sodio a través de la membrana celular nerviosa, paralizando el flujo del
impulso nervioso que causan los síntomas de PSP (Mosher et
al., 1964).
Saxitoxinas
y sus espontáneas transformaciones son el principal factor de impedimento
para el desarrollo de una simple prueba de campo para medir toxinas
(Sullivan y Wekell, 1988).
El
bioensayo de ratón, método aprobado por la Oficina de Administración de
Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA, siglas en inglés) como un
procedimiento para detectar y cuantificar toxinas en moluscos, mide simultáneamente
todas las toxicidades del total de saxitoxinas a partir de una muestra de
tejido del molusco. Sin embargo, este método es debil para detectar
eficientemente análogos de saxitoxinas de bajas toxicidades (toxinas B y
C, Figura 1) (Casais Laiño, 1991).
MATERIALES
Y METODOS 1.
Muestras
Muestras
de mejillones (Perna viridis) y
ostras (Crassostrea rhizophorae y
C. virginica)
se recolectaron en bancos naturales en seis localidades de Venezuela
ubicadas en los estados Sucre y Nueva Esparta y cuatro a lo largo de la
costa occidental de Trinidad (Cuadro 1 y Figura 2). El muestreo se realizó
en junio de 2000. Todo el tejido de las muestras fue extraído y
almacenado congelado hasta su análisis. La identificación de las
diferentes especies de ostras y mejillones fue efectuada en el
Departamento de Biología de la Universidad de Oriente (Prof. Antulio
Prieto) y con un catálogo de moluscos marinos de las costas de Venezuela
(Lodeiros et al., 1999). 2.
Preparación de las muestras para el HPLC
Las
muestras de ostras (Crassostrea rhizophorae y crassostrea
virginica) y mejillones (Perna
viridis) se extrajeron de acuerdo al procedimiento usado para el
bioensayo de ratón (A.O.A.C, 1990). Cien gramos de tejido licuado y
homogenizado fueron hervidos con 100 ml de 0,1 mol/l HCl. Después de
hervir por 5 minutos y enfriado, el pH fue ajustado aproximadamente a un
valor de 3 con NaOH (1mol/l) y el extracto se centrifugó a 4000 rpm por
12 min. El líquido sobrenadante se decantó cuidadosamente en un envase
plástico y se almacenó a –4°C
hasta que el análisis se realizó. Previo al análisis, un procedimiento
de extracción de fase sólida en microcolumnas (500 mg/3 ml de volumen)
fue aplicado para limpiar las muestras. La sílica gel fue derivada con
modificaciones del procedimiento sugerido por Knapp (1979). Cada
microcolumna usada se acondicionó con 6 ml de etanol, seguido de 6 ml de
agua. A cada microcolumna se le agrego 1 ml de extracto y el efluente se
recolectó en un vial (5,0 x 1,8 cm de diámetro) limpio y prepesado. La
microcolumna fue eluida con 2 ml de agua y el efluente combinado en el
vial. El vial fue repesado y se le adicionó agua desionizada hasta
obtener una masa del extracto de 4 g. Las alícuotas de cada extracto
fueron usadas para la reacción de oxidación con ácido peryódico,
previo al análisis con el HPLC.
3.
Reacción
de oxidación
El
reactivo para la oxidación de las muestras se preparó diariamente de
acuerdo a lo recomendado por Lawrence et
al. (1996), mezclando 5 ml de 0,03 mol/l de ácido peryódico, 0,3
mol/l de formato de amonio y 0,3 M de Na2HPO4. Se
ajusto el pH a 8,2 usando 0,2 mol/l de NaOH. En un vial de 1,5 ml, se
preparó una mezcla de 100 ml
de extracto de molusco o de estándar y de 500 ml
del reactivo oxidante con un mezclador vortex. La solución se dejó
reaccionar a temperatura ambiente por 1 minuto, se le agrego 5 ml
de ácido acético glacial y se mezcló para estabilizar el producto de la
reacción. La mezcla se dejo en reposo por 10 minutos adicionales a
temperatura ambiente antes de ser inyectada al sistema cromatográfico.
4.
Análisis cromatográfico
El
sistema de cromatografía líquida consistió de una bomba de gradientes
(LKB Model 2249) un puerto de inyección (Rheodyne, Model 2494) para 20 ml
de muestra. Se usaron cuatro columnas de fase reversa y C18 de
diferentes casas comerciales. Un espectrofotómetro de luminiscencia
(Perkin Elmer, Model LS50B) fijado a 330 nm (excitación) y 400 nm (emisión),
ajustado a una celda de flujo para cromatografía líquida de alta
resolución, fue usado para monitorear el efluente de la cromatografía líquida.
Se usó una fase móvil por gradiente de acuerdo a Lawrence et
al. (1996), esto es: 0-1% acetonitrilo los primeros 15 minutos y 1- 4%
los 7 minutos restantes. Las concentraciones de las toxinas se
determinaron por comparación del área del pico de cada toxina con los de
los patrones calibrados.
Las soluciones certificadas de calibración que contienen STX,
NEOSTX, GTX1,4, GTX2,3 utilizadas para preparar la curva de calibración
fueron obtenidas del National Research Council of Canada.
Con
el método de cromatografía líquida de alta resolución con detección
de fluorescencia y reacción previa se conformó la detección de
saxitoxinas por su espectro de absorción y emisión (Figura 3). La
saxitoxina presentó el mismo tiempo de retención en su cromatograma,
como toxina individual y en una mezcla con GTX1,4, NeoSTX, GTX2,3 (Figura
4), lográndose la separación de importantes pares de toxinas (STX/NEO,
GTX1,4/GTX2,3), pero la resolución y la altura de los picos de los
productos de oxidación de esas toxinas variaron dependiendo de la
eficiencia de las columnas utilizadas. Con reacción precolumna es difícil
separar los epímeros GTX1 de GTX4 y GTX2 de GTX3.
El
orden de elusión de las toxinas en los cromatogramas obtenidos estuvieron
en concordancia con lo planteado por Lawrence et
al. (1995). El rendimiento fue de 85-104% por adicionar
concentraciones conocidas de toxinas a muestras no contaminadas. El límite
de detección fue de 10 mg
PSP/100 g de tejido de molusco comparado con 40 mg
PSP/100 g obtenido por el bioensayo con ratones. Con respecto a las
muestras analizadas, solamente gonyaulatoxina GTX2,3 fue detectada en
muestras de Chaguaramas (Perna
viridis), Trinidad, Guiria (C.
virginica), Río Caribe (Perna
viridis) y Yaguaraparo (C.
virginica), estado Sucre, Venezuela (Cuadro 1, Figura 2); en
concentraciones que estuvieron por debajo de los límites permisibles
(<80 mg/100
g tejido fresco). La baja toxicidad de las muestras fue confirmada por la
técnica de bioensayo del ratón, en la cual, los ratones sólo
presentaron algunos síntomas asociados a PSP, pero no murieron. Esto
impidió calcular con exactitud la toxicidad real de la muestra.
Los
resultados demuestran que el método de reacción precolumna provee una
información rápida acerca de la composición de las toxinas,
independiente de la matriz del organismo receptor. Además, resulta un método
simplificado para el monitoreo de toxinas PSP en moluscos del Caribe, zona
que incluye a Trinidad y a Venezuela y en la cual las células de algas tóxicas
son movilizadas, concentradas o dispersadas por los vientos, mareas y
corrientes marinas, y donde probablemente los moluscos filtradores llegan
a ser más tóxicos que en las áreas con concentraciones más altas de
estas algas. RECOMENDACIONES
Continuos
estudios son necesarios para mejorar la identificación y cuantificación
de los diferentes derivados fluorescentes usando el método de cromatografía
líquida de alta resolución, que logren separar aquellos pares de
toxinas, tales como: GTX1 de GTX4 y GTX2 de GTX3, hasta ahora no logrado
con el método de oxidación previa.
El
financiamiento para realizar esta investigación fue aportado por el por
el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, The University
of the West Indies y por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Tecnológicas (CONICIT). Se agradece la colaboración prestada por la
Embajada de Venezuela en Trinidad, la Guardia Nacional de Venezuela, el
Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIBCA), el Instituto Oceanográfico
de Venezuela, y el Instituto de Estudios del Mar de la UDO. Determination
of saxitoxin and its derivatives in mollusk bivalves: Evaluation and
optimization of the high performance liquid chromatographic use with
fluorescence detection and prior oxidation SUMMARY Saxitoxin
and its derivatives are potent neurotoxins associated with paralytic
shellfish poisoning (PSP) in humans which are primarily produced by
dinoflagellates. To evaluate and optimize the use of high performance
liquid chromatography (HPLC) with previous oxidation in order to determine
saxitoxin and its derivatives, samples of the green mussel (Perna
viridis) and oysters (Crassostrea
sp) were collected at six locations in Venezuela and at four in
Trinidad, the latter along the west coast line, in June 2000. The samples
were extracted using the AOAC bioassay mouse procedure. Each extract was
oxidized using periodic acid and the oxidation product was injected to the
chromatographic column. The method used to HPLC in this work was a
modification of Lawrence et al.
(1996). The separation of important pairs of toxins (STX/NEO,
GTX1,4/GTX2,3) were achieved, but the resolution and height of the peaks
of oxidation products of these toxins varied depending on column
efficiencies. Some samples had presence of PSP below permissible levels,
which was confirmed by using bioassay mouse method. The results showed
that the reaction precolumn method gives prompt information about profile
of the toxins, which is independent of matrix of receptor organism, and it
is a simple method for monitoring PSP in shellfish in the Caribbean. Key words: saxitoxin, PSP, neurotoxin, dinoflagellate, toxic. BIBLIOGRAFÍA Ammons
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