|
Zootecnia
Tropical 22(3):251-263. 2004 La Concanavalina A reduce la Energía Metabolizable Verdadera del maíz Adriana Méndez1, Rubén E. Vargas, Lilliam Sivoli y Coromoto Michelangeli
[1]
Centro de Bioquímica Nutricional, Facultad de Ciencias Recibido 17/06/04 Aceptado 03/11/04 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
RESUMEN Se condujo un ensayo de balance para evaluar el efecto de la Con A sobre el valor de energía metabolizable verdadera, corregida para un balance de nitrógeno (EMVn) del maíz. Siete gallos Rhode Island Red fueron asignados aleatoriamente a los siguientes tratamientos: a) maíz amarillo molido (MAM) y b) MAM + 200 mg de Con A. Las heces fueron recolectadas a las 48 y 72 h. La Con A estudiada fue aislada y purificada a partir de granos crudos de Canavalia ensiformis y su capacidad de unión a la mucosa intestinal fue determinada en pollos de engorde de 3 semanas de edad y en gallos adultos. Los resultados revelan que la Con A redujo significativamente(P<0,05) la EMVn del maíz, en 130 kcal/kg. Solo en pollos de engorde de 3 semanas de edad se observo unión de la Con A a la mucosa intestinal lo cual indica que el efecto de la Con A posiblemente se debió a la acción de la lectina sobre la actividad de las enzimas digestivas, en el lumen intestinal. La ausencia de unión de la Con A al intestino de gallos adultos, unida al menor valor de EMVn encontrado, indica que algunos efectos antinutricionales de la Con A no requieren de su asociación con el intestino y es de esperarse que los mismos sean mas evidentes en aves jóvenes. Palabras clave: Concanavalina A, energía metabolizable verdadera, gallos. Concanavalin A reduces the True Metabolizable Energy value of corn SUMMARY A balance trial was conducted to evaluate the effects of Con A on the True Metabolizable Energy corrected to zero nitrogen balance (TMEn) of corn samples. Seven Rhode Island Red roosters were randomly assigned to each one of two dietary treatments: a) ground yellow corn (GYC), and b) GYC + 200 mg of Con A. Feces were collected within 48 and 72 hours. The Con A employed in this trial was isolated and purified from raw seeds of Canavalia ensiformis and its binding ability to the intestinal mucosa was determined in 3-week old chicks and adult roosters. The data reveal that Con A binded to the intestinal mucosa only in chicks, which indicates that the effect of Con A on corn TMEn was probably due to the lectin effects on the digestive enzymes activity in the intestinal lumen. The absence of Con A in the intestine mucosa of adult roosters along with the significant (P<0,05) reduction of the TMEn of corn observed indicate that some of the antinutritional effects of Con A in poultry require no binding to the intestinal brush border membrane. Also, it is possible to infer that yet these effects would more marked in young chicks. Key words: Concanavalin A, TMEn, corn, roosters, chicks. INTRODUCCIÓN Muchas de las leguminosas utilizadas para la alimentación de humanos y animales contienen cantidades apreciables de compuestos o metabolitos tóxicos, genéricamente denominados factores antinutricionales (FAN). Este termino incluye, entre otros, los inhibidores de tripsina, taninos, aminoácidos no proteicos, fitatos, lectinas, los cuales pueden ser tóxicos o causar disminución de la digestibilidad de los nutrientes, cuando están presentes en altas concentraciones en las dietas (Sgarbieri y Whitaker, 1982). Las lectinas constituyen, aproximadamente, el 20% de las proteínas totales de los granos leguminosos que los contienen. Los granos crudos de la leguminosa Canavalia ensiformis son una fuente alternativa potencial de nutrientes en dietas para aves; sin embargo, su utilización se ha dificultado por las reducciones significativas del consumo de alimento y ganancia de peso, observadas cuando han sido incorporados en cantidades superiores al 5 %, en raciones para pollos de engorde (León, 1989; Kessler et al., 1990; D´Mello y Walker, 1991). A la Con A, cuando los granos crudos de Canavalia ensiformis son incorporados a las dietas para pollos de engorde, se le ha atribuido un 70% a 80 % de las manifestaciones tóxicas estudiadas (León et al., 1991). Estos efectos se asocian a la capacidad de la Con A de resistir la proteólisis digestiva (Pusztai et al., 1991) y, una vez en el lumen intestinal, ser capaz de unirse a la mucosa, causando lesiones cuyo grado de severidad depende, en gran parte, de la cantidad de Con A presente en la dieta (Méndez et al., 1998). Adicionalmente, en estudios in vitro se ha observado que esta lectina reduce la actividad de algunas enzimas digestivas, en particular, la amilasa salival y pancreática (Thompson et al., 1987). Aunque los efectos biológicos de la Con A sobre la actividad enzimática digestiva in vitro y las lesiones sobre la mucosa intestinal han sido plenamente demostradas, los efectos de la Con A de los granos de Canavalia, sobre el valor de la energía metabolizable del maíz no han sido investigados. Este es precisamente el objetivo del presente trabajo. MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento y Purificación de la Con A La Con A fue aislada a partir de la harina desgrasada de granos de Canavalia ensiformis por cromatografía de afinidad. Su pureza fue determinada por electroforesis SDS-PAG (Laemmli, 1970). Actividad de la Con A La actividad de la ConA se determinó in vitro de acuerdo a Kohle y Kaus (1980) y se comparó con una muestra de Con A comercial grado IV (Sigma, St. Louis, MO.) y con muestras de harinas de granos crudos de Canavalia. Unión a la Mucosa Duodenal Para evaluar la capacidad e intensidad de unión de la Con A, previamente aislada, 4 pollos de la línea comercial Arbor Acres de 3 semanas de edad y 2 gallos adultos de la línea comercial Rhode Island Red, fueron intubados con 5 mL de solución fisiológica + 200 mg de Con A. Transcurridas 8 horas, se sacrificaron y se tomaron muestras de duodeno, las cuales fueron procesadas de acuerdo a la técnica inmunohistoquímica descrita por Hsu et al. (1981). Prueba de Digestibilidad Se realizó un ensayo de balance siguiendo la metodología de Sibbald (1986), para estimar el valor de EMVn de la harina de maíz y de la harina de maíz + Con A (200 mg). Se emplearon 7 gallos adultos de la línea comercial Rhode Island Red por cada tratamiento. Los gallos, alojados en jaulas metabólicas individuales provistas de bandejas para la recolección de las excretas, fueron sometidos a un ayuno de 24 horas antes del inicio del experimento. Los tratamientos fueron asignados a los gallos en forma aleatoria y cada gallo recibió directamente en el buche, con ayuda de un embudo, 40 g del tratamiento experimental correspondiente. Las heces fueron recolectadas a las 48 y 72 horas postintubación. Siete gallos fueron mantenidos en ayuno con el propósito de estimar las perdidas endógenas. Las harinas de maíz y las heces recolectadas fueron analizadas para determinar el contenido de materia seca (AOAC, 1984); proteína total por microkjeldahl, (AOAC, 1990). Los cálculos del contenido de Energía Metabolizable Verdadera corregida para un balance de nitrógeno nulo (EMVn), se realizaron mediante la fórmula propuesta por Sibbald (1986):
donde: EMVn = Energía metabolizable verdadera corregida para un balance de nitrógeno nulo (kcal / kg MS) MSI = Materia seca ingerida (g) EBA = Energía bruta del alimento (cal / g alimento) ENA = Energía del nitrógeno del alimento (cal / g) MSE = Materia seca excretada (g) EBH = Energía bruta de las heces (cal / g) ENH = Energía del nitrógeno de las heces (cal / g) MSend = Materia seca del endógeno (g) EBend = Energía bruta del endógeno (g) ENend = Energía del nitrógeno endógeno (cal / g).
RESULTADOS Pureza de la Concanavalina A Los resultados de SDS-PAGE tenidos con Azul de Comassie (Microfotografía 1) realizados tanto a los extractos de Canavalia y en las fracciones recolectadas revelaron la presencia de la Con A, lo cual fue adicionalmente confirmado mediante la electroforesis con un marcador de peso molecular y con Con A grado IV. Las fracciones recolectadas de la columna de cromatografía de afinidad revelaron la presencia de Con A y sus subunidades, no así en los extractos que contenían otras proteínas de diferente peso molecular, extraídas durante el proceso. Actividad Hemaglutinante La actividad hemaglutinante de la Con A (Cuadro 1) fue de + 3 en las harinas de granos crudos de Canavalia; para la Con A aislada la actividad fue de + 12 y las harinas de maíz mezcladas con 200 mg de Con A presentaron una actividad hemaglutinante de +1. La determinación de la actividad hemaglutinante en la harina de maíz sin Con A fue realizada para descartar la posible presencia de lectinas con capacidad de aglutinar glóbulos rojos de conejo y probó ser negativa.
Capacidad de unión a la mucosa duodenal de la Con A aislada La Microfotografía 1 muestra una reacción positiva a la unión de la Con A, en el borde en cepillo de la mucosa duodenal de pollos de engorde de 3 semanas de edad, intubados con 5 mL de solución fisiológica + 200mg de Con A aislada. En el caso de los gallos adultos intubados con la misma solución de Con A no se observo unión de la lectina a la mucosa intestinal. La reacción positiva a la unión de la Con A en el duodeno de pollos de engorde se clasificó de moderada a débil, ya que cuatro vellosidades resultaron moderadamente positivas y cuatro débiles (Cuadro 2).
Efecto de la Con A sobre el valor de la Energía Metabolizable Verdadera corregida para un balance de nitrógeno nulo (EMVn) de la harina de maíz El valor de EMVn del maíz a las 48 y 72 horas de recolección fue significativamente menor (P<0,05), en muestras que contenían Con A (Cuadro 3).
DISCUSIÓN El principal objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto de la Con A, lectina presente en los granos de la Canavalia ensiformis, sobre el valor de EMVn de la harina integral de maíz. Investigaciones previas han demostrado un amplio rango de efectos biológicos en animales alimentados con dietas que contienen lectinas, ya sea en forma purificada (Banwell et al., 1983) o como componente de granos crudos de leguminosas (Grant et al., 1985) o procesados con la aplicación de calor (León et al., 1989). Los efectos mas conspicuos observados en la mucosa del tracto digestivo incluyen la unión de las lectinas a las vellosidades intestinales interfiriendo con la digestión (King et al., 1980; Lorenzson y Olsen, 1982) y absorción de los nutrientes (Donatucci et al., 1987); la reducción de la actividad de la amilasa pancrática (Jenkis et al., 1980; Jenkis et al.1986), la pepsina (Thompson et al., 1986) y varias asociadas a la mucosa tales como la sacarasa, leucina aminopeptidasa y la fosfatasa alcalina (Nakata y Kimura, 1985). Estos efectos se facilitan por la resistencia de las lectinas a la acción hidrolítica de las mismas enzimas digestivas (Pusztai et al., 1990) por lo cual, son excretadas en forma casi inalterable en las heces (Nakata y Kimura, 1985). Adicionalmente, las lectinas luego de su unión a la mucosa duodenal, pueden ser internalizadas y transferidas a la circulación sistémica ejerciendo diversos efectos fisiológicos en el organismo de los animales que resultan, eventualmente, en retardo del crecimiento y hasta en la muerte (Pusztai, 1991). A pesar de la abundante experimentación que sustenta la acción antinutricional de las lectinas, los resultados del presente trabajo muestran, por primera vez, el efecto de la lectina Con A sobre el valor de EMVn de un ingrediente como el maíz, al reducir significativamente (P<0,05) su contenido de 3.932 a 3.800 kcal/kg de MS, luego de 48 horas de recolección de las heces (Cuadro 3). Como era de esperarse, este efecto sobre la EMVn estuvo acompañado de una mayor excreción de materia seca. En virtud de que la Con A fue extraída y purificada como parte de este trabajo, existía la posibilidad de que el mismo proceso de aislamiento de la lectina le hubiera modificado sus propiedades biológicas, a través de cambios en su estructura cuaternaria, tal como ha sido observado por Sanz et al. (1997) y por Michele et al. (1999). El Cuadro 1 muestra que la Con A aislada mantuvo su actividad hemaglutinante y también su integridad estructural evidenciada por electroforesis (Microfotografía 2) Sin embargo, era posible que su capacidad de reconocer los azucares receptores de la mucosa intestinal, pudiera haber sido afectada durante el proceso de aislamiento. Para evaluar esta posibilidad, la Con A aislada fue suministrada también a pollitos de engorde de 3 semanas de edad, cuyos intestinos habían previamente mostrado una alta afinidad por la Con A (Méndez et al., 1998). Los cortes histológicos mostrados en el panel B de la Microfotografía 1, comprueban que la Con A mantuvo su propiedad de reconocer y combinarse con los azucares específicos (principalmente la manosa) de la mucosa duodenal, si estos están presentes. Es decir, la falta de unión de la Con A con la mucosa duodenal de los gallos, no puede ser atribuida a la pérdida de propiedades biológicas de la lectina purificada en nuestro laboratorio. Es posible entonces que la ausencia de Con A en la mucosa pudiera estar relacionada con los cambios en el patrón de glicosilación que tienen lugar a medida que la aves envejecen, como ha sido demostrado por otros autores (March et al., 1973). Estas observaciones también constituir una explicación a los efectos tóxicos más severos de las lectinas reportados en los animales jóvenes (Flores et al., 1994).
En el presente trabajo, la utilización de la coloración de PAS (McManus, 1946), específica para mucinas neutras que contienen manosa y glucosa en su composición, permitió constatar que los gallos adultos, empleados en el ensayo de balance, solo contenían trazas de mucinas neutras en las criptas y vellosidades en comparación con los pollos jóvenes. Es claro, entonces que la reducción del valor de EMVn del maíz no puede ser explicada con base en los efectos de la Con A sobre la mucosa intestinal. Es decir, la interferencia de la lectina con la utilización de la fracción energética del maíz ocurrió fundamentalmente en el lumen del intestino. En este sentido, Rouanet et al. (1983) señalaron que las lectinas pueden, en la luz intestinal, modificar directamente la actividad de las enzimas digestivas o combinarse con los nutrientes, limitando así la acción enzimática. Thompson y Gabon (1987) demostraron que la Con A reduce significativamente la actividad in vitro de las amilasas salival y pancreática, mediante una inhibición no competitiva. Asimismo, Jindal et al. (1982) encontraron que la actividad de la disacarasa fue reducida en ratas alimentadas con una dieta semipurificada a la cual se le había añadido lectina. Similarmente, dietas que contenían lectinas de frijoles exhibieron marcada mala absorción de diversos nutrientes incluyendo lípidos, nitrógeno y vitamina B12. Sjolander et al. (1984) reportaron que la Con A reduce la permeabilidad intestinal. Los resultados de nuestra investigación sugiere que, aunque no es posible precisar el mecanismo por el cual la Con A afecta la utilización de la energía (mayormente proveniente de los carbohidratos) del maíz; sin embargo, es muy probable que dicho efecto haya ocurrido como consecuencia de la acción de la Con A sobre la acción hidrolítica de las enzimas digestivas. Los resultados obtenidos también ratifican que la unión de las lectinas con la mucosa intestinal no es un evento previo requerido para interferir con la utilización de los nutrientes por los animales, como ha sido sugerido por otros investigadores (Pusztai, 1991). Desde el punto de vista práctico, la Con A o los ingredientes que la contienen como es el caso de los granos de Canavalia ensiformis, cuando forman parte de la dieta es de esperar que interfieran con la utilización de los nutrientes dietéticos al reducir su contenido de energía metabolizable; efecto este que podria tener mayor impacto en los animales en crecimiento. Un punto a considerar, en este contexto se refiere a la cantidad mínima de Con A que debe estar presente en la dieta para observar los efectos sobre la EMVn. En el presente ensayo se utilizaron 200 mg de Con A. Es factible que dosis menores no muestren tales efectos. En este sentido, Méndez et al. (1998) encontraron que los pollos de engorde pueden tolerar hasta 100 mg de Con A en la dieta sin mostrar efectos sobre la ganancia de peso y la conversión alimenticia. En todo caso, la cantidad mínima de Con A a la cual el valor de EMVn del maíz o de la dieta comienza a manifestarse, esta aún por determinarse. CONCLUSIONES Los resultados revelan que la Con A reduce significativamente (P<0,01; en 139 kcal/kg) la EMVn del maíz. Sólo en los pollos de engorde se observo unión de la Con A en la mucosa intestinal lo cual indica que el efecto de la Con A posiblemente se debió a la acción de la lectina sobre la actividad de las enzimas digestivas en el lumen intestinal. La ausencia de Con A en la mucosa de los gallos, unida al menor valor de EMVn encontrado, indica que los efectos antinutricionales de la Con A no requieren de su asociación con el intestino como ha sido sugerido por otros investigadores y es de esperase, que estos efectos resulten mas marcados, en aves jóvenes. BIBLIOGRAFÍA AOAC. 1984. Official Methods of Analyses. Association of Official Analytical Chemist. 13ra Ed. Washington, D.C. AOAC. 1990. Official Methods of Analyses. Association of Official Analytical Chemist 15ta Ed.. Washington, D.C. U.S.A. Methods 920. 39-961. 06-962. 10-967. 04. , pp:37, 79, 736-737. Agrawal, B.B.L. y Goldstein, Y.J. 1965. Specific binding of Concanavalin A to cross-linked dextran gels. Biochem. J.,96:23C-25C. Banwell J. G., Boldt D. H., Meyers J., Weber F. y Howard R. 1983. Phytohemagglutinin derived from red kidney bean (Phaseolus vulgaris): a cause for intestinal malabsortion associated with bacterial overgrowth in the rat. Gastroenterol., 84: 506-515. D´Mello J. P. y Walker A. G. 1991. Detoxification jack beans (Canavalia ensiformis): Studies with young chicks. Anim. Feed. Sci. Technol., 33:117 -127. Donatucci, D. A., Liener, I. E. y Gross, C. J. 1987. Binding of Navy bean (Phaseolus vulgaris) lectin to the intestinal cells of the rat and its effect on the absorption of glucose. J. Nutr., 117:2154-2160. Flores M. P., Castañon J. I. R. y McNab J. M. 1994. Effect of tannins on starch digestibility and TMEn of triticale and semipurified starches from triticale and field beans. Br. Poultry Sci., 35:281-286. Grant G., Dorward P. M., Buchan W. C., Armour J. C. y Pusztai A. 1985. Consumption of diets containing raw soy bean (Glycine max), kidney beans (Phaseolus vulgaris), cowpeas (Vigna unguiculata) or lupin seeds (Lupinus angustifolius) by rats for up to 700 day: effects on body composition and organ weights. Br. J. Nutr., 73 (1):17-29. Hsu S. M., Raine L., y Fanger H. 1981. Use of Avidin – Biotin – Peroxidase Complex (ABC) in immunoperoxidase techniques. J. Histochem Cytochem., 29:577- 580. Jenkins D. J. A. 1982. Lentil carbohydrates: a newer approach to the dietary management of diabetes. Diabetes Care, 5:634-641. Jenkins D. A., Wolevor T. M. S., Taylor R. H., Baker H. M. y Fielden, H. 1980. Exceptionally low blood glucose response to dried beans: Comparison with other carbohydrate food. Br. Med. J., 281:578-580. Jindal S., Soni G. L. y Singh R. 1982. Effect of binding of lectins from lentils and peas on the intestinal and hepatic enzymes of albino rats. J. Plant Foods, 4:95-103. Kessler M., Belmar R. y Ellis N. 1990. Effects of autoclaving on the nutritive value of the seeds of Canavalia ensiformis (Jack bean) for chicks. Trop. Agric., 67:16 -20. King T. P., Pusztai A. y Clarke E. M. W. 1980. Kidney bean (Phaseolus vulgaris) lectin-induced lesions in rat small intestine: 1. Light microscope studies. J. Comp. Pathol., 90:585-595. Kohle H. y Kaus H. 1980. Improved analysis of hemaglutination assays for quantitation of lectin activity. Anal. Biochem., 103:227-229. Laemmli U. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-687. León A. 1989. Estude d´ une legumineuse tropicale nouvelle pour L´alimentation du poulet (Gallus gallus) : Canavalia ensiformis. Tesis Doctoral. Universite Paris. 105 p. León A., Caffin J. P., Plassart M y Picard M. 1991. Effect of Concanavalin A from Jack bean seeds on short – term food intake in chicken. Anim. Feed. Sci. Technol. 32:297-311. León A., Vargas R. E., Michelangeli C., Melcion J-P. y Picard M. 1998. Detoxification of jackbean (Canavalia ensiformis L.) with pilot scale roasting. II: Nutritional value for poultry. Anim. Feed Sci. Tecnol., 73:231-242. Lorenzsonn V. y Olsen W. A. 1982. In vivo reponses of rat intestinal epithelium to intraluminal dietary lectins. Gastroenterol., 82:838-848. March B. E., Smith T. y El-Lakany S. 1973. Variation in estimates of the Metabolizable Energy value of rape seed meal determined with chickens of different ages. Poultry Sci., 52:614-618. McManus D. y Ofeck I. 1946. Histological demonstration of mucin after periodic acid. Nature, 158 : 202. Méndez A., Vargas R. E. y Michelangeli C. 1998. Effects of Concanavalin A , fed as constituent of Jack bean (Canavalia ensiformis L.) seeds, on the humoral immune response and performance of broiler chickens. Poultry Sci., 77:282-289. Michele D., Parson C. M. y Hymowitz T. 1999. Nutritional evaluation of lectin-free soybeans for poultry. Poultry Sci., 78:91-95. Nakata S. y Kimura T. 1985. Effect of ingested toxic bean lectins on the gastrointestinal tract in the rat. J. Nutr., 115:1621-1629. Pusztai A. 1991. Plant Lectins. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Pusztai A., Ewen S. W. B., Grant G., Pneumans W. J., van Damme E. J. M., Rubi L. y Bardocz S. 1990. The relationship between survival and binding of plant lectins during small intestinal passage and their effectiveness as growth factors. Digest., 46:308-316. Pusztai A., Ewen S., Yule M. y Bardoccz S. 1991. Effects of Concanavalin A and Phaseolus vulgaris lectin (PHA) on the gut and systemic metabolism of germ-free and conventional rats. En: Vargas, R.E., A. Leon y A Escobar (eds). Canavalia ensiformis (L.) DC. Produccion, Procesamiento y Utilización en Alimentación Animal. Editorial Futuro. San Cristóbal, Venezuela. Rouanet J. M., Besancom P. y Lafint J. 1983. Effect of lectins from leguminous seeds on rat duodenal enterokinase activity. Exp., 39:1356-1358. Sanz-Aparicio J., Hermoso J., Grangeiro T. B. y Cavada B. S. 1997. The crystal structure of Canavalia brasiliensis lectin suggests a correlation between its quaternary conformation and its distinct biological properties from Concanavalin A. Febs Lett., 405(1):114-118. Sgarbieri V. y Whitaker J. R. 1982. Physical, chemical and nutritional properties of common bean proteins. Adv. Food Res., 28:93-166. Sibbald I. R. 1986. The T.M.E. system of feed evaluation: methodology, feed composition data bibliography. Technical Bulletin 1986 – 4E. Res. Branch, Agric. Canada, Ottawa, ON, Canada. Sjolander A., Magnusson K. E. y Latkovies A. 1984. The effect of Concanavalin A and wheat germ agglutinin on the ultra structure and permeability of rat intestine. A possible model for an intestinal allergic reaction. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 73 (3):230-236. Thompson L. y Gabon J. 1987. Effect of lectins on salivary and pancreatic amylase activities and the rate of starch digestion. J. Food Sci., 52(4):1050-1053. Thompson L. U., Tenebaum A.V. y Hui H. 1986. Effect of lectins and the mixing of proteins on rate of protein digestibility. J. Food Sci., 51:150-152. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
