Caña de Azúcar,  Vol. 10(2): 61-70. 1992

OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE sub-clones DE CAÑA DE AZÚCAR RESISTENTES A LA ROYA A PARTIR DE LA VARIEDAD C127-78 MEDIANTE CULTIVO DE TEJIDOS. 

O. Nodarse*, I. Santana*, A. Chinea*, L. Carbó*, A. Díaz* y C. Hernández * 

*EPICA "Antonio Mesa Hernández". INICA-MINAZ G.P.
 6070, Boyeros, La Habana, Cuba

RESUMEN 

Con el objeto de obtener subclones resistentes a la roya (Puccinia melanocephala H y P Sydow) a partir de la variedad de caña de azúcar susceptible C127-78, fueron sembrados trozos de hojas inmaduras sobre el medio Payan, suplementado con 5 mg/l de 2,4-0 y 18 % de agua de coco. A los callos obtenidos de le aplicó mutágenos físicos y químicos a las siguientes dosis. a) Rayos X. 80; 100; 110 y 120 Kv. b) Rayos Gamma.1000; 2000 y 3000 rad. c) Azida Sódica. 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05 y 0, 1 %. Las planticas regeneradas fueron colocadas en vivero, donde se eliminaron las que mostraron síntomas severos de roya. Las restantes se plantaron en el campo donde se observó y se evaluó su estado fisosanitario, comparando cada subclon con la variedad donadora y los testigos 84362 (susceptible) y PR980 (resistente) utilizando una escala de 5 valores Fueron seleccionados 15 subclones de los tratados con 80 Kv de Rayos X, que presentaban roya en grado 1 y 2; mientras que la variedad donadora alcanzó el grado 4 Todos los subclones procedentes de las otras variantes resultaron susceptibles y fueron eliminados. Los 15 subclones seleccionados y la variedad C127-78 se multiplicaron en el campo ya los 5 meses de edad fueron caracterizados por su susceptibilidad a la roya y registrados los valores de altura, diámetro y color de los tallos, número de tallos por cepa y longitud de los entrenudos. A los 12 meses se les midió altura, Brix, diámetro y número de tallos. El subclon 3 mostró grado 1 y el resto grado 2 de la enfermedad, mientras que la variedad donadora mantuvo el grado 4 (altamente susceptible) Se seleccionaron los subclones 9 y 15 por su alto contenido de 8rix y por su resistencia a la roya.

INTRODUCCIÓN 

Es conocido que la obtención de una variedad comercial mediante el proceso de mejoramiento gen ético, requiere el empleo de cuantiosos recursos humanos y materiales, debido a que en la actualidad son numerosas las características que debe reunir un genotipo para ser introducido en la producción Por tal motivo, la recuperación de una variedad con altos rendimientos tiene una gran trascendencia y el valor de dicha recuperación se iría acumulando paulatinamente en función de los porcentajes que pueda ocupar en áreas de producción el nuevo subclon obtenido.

Por la importancia que tiene la producción azucarera para Cuba, se hace necesario el empleo de técnicas novedosas que permitan obtener nuevas y mejores variedades, resistentes a plagas y enfermedades, además de las características botánicas y agronómicas superiores para su explotación agroindustrial De allí que el desarrollo alcanzado por las técnicas de cultivo in vitro en los últimos años, la convierten en un valioso instrumento para la investigación en el campo de las ciencias básicas aplicadas, en el estudio de la fitopatología, mejoramiento gen ético y propagación vegetativa El mejoramiento mediante esta técnica ha dado posibilidades de selección de diferentes mutantes en los cultivos (2). 

El cultivo in vitro consiste en colocar material muy reducido de un tejido vegetal en un medio sintético químicamente definido, para que se desarrolle en él, individuos genéticamente diferentes al individuo inicial. 

Esta establecido que diferentes modificaciones génicas puedan ocurrir durante el proceso de cultivo de tejidos "in vitro" y que muchas de esas modificaciones están manifestadas como mutaciones heredables entre las progenies y las plantas regeneradas. Este proceso, llamado variación somoclonal, puede ser definido como la variabilidad generada durante el proceso de cultivo de tejidos (2).

Entre los factores que influyen en la variación somoclonal en caña de azúcar se tiene 

1. VARIEDAD: Es uno de los factores que más influyen en la variación somoclonal, demostrándose que la capacidad de encontrar variaciones en las diferentes variedades depende de éstas. 

Existen variedades que presentan alto porcentaje de variabilidad después de un proceso de cultivo de tejidos. mientras que en otras es necesario la inducción de mutaciones para lograr este objetivo.

2. TIEMPO DE CULTIVO: Existen resultados que plantean que períodos prolongados de cultivo de tejidos incrementaron la frecuencia de las variaciones somoclonales entre las plantas. Se ha observado que en períodos prolongados de cultivo. ocurre la pérdida de totipotencia o capacidad de regenerar plantas en callos de caña de azúcar y en dependencia de la variedad. 

3. INDUCCIÓN DE MUTACIONES: Las mutaciones somáticas se originan mediante cambios en las células del individuo en vías de desarrollo en diversas partes del vegetal. En cultivo de tejidos estas variaciones son muy frecuentes y aún más cuando se usan agentes mutagénicos. 

Las técnicas de mejoramiento por cultivo de tejidos y células han dado la posibilidad de seleccionar diferentes mutantes deseables La gran ventaja de estas técnicas, es el alto número de células que pueden ser tratadas fácilmente con los agentes mutagénicos en cultivo "in vitro", incrementándose los mutantes aportados y por lo tanto, la selección de variables deseables. 

Según Cornide (1), la idea de provocar mutaciones artificialmente y emplearlas con fines mejoradores fue planteado a principio de siglo, por Hugo de Vries. Durante una conferencia celebrada en Call Spring Harber en 1904, propuso el empleo de los rayos X, descubiertos hacía sólo nueve años por Roentgen. 

Se conocen varios agentes que afectan el valor de la mutación; entre los principales tenemos las mutaciones ionizantes en las que se incluyen los rayos X, neutrones, protones, emisiones alfa, beta y gamma (8). En caña de azúcar se han reportado trabajos sobre el efecto de mutágenos químicos sobre células en suspensión (3,4). Una ampliación importante ha sido la selección de clones después de tratamientos con mutágenos, con vistas a buscar rendimientos azucareros (6, 7). 

Teniendo en cuenta que la variedad de caña de azúcar C127-78 posee características agro productivas y azucareras destacadas, pero ha resultado susceptible a la enfermedad roya de la caña de azúcar producida por el hongo Puccinia melanocephala, H. and P. Sydow, se creyó conveniente obtener subclones en los que se hubiera eliminado ésta característica indeseable, mediante el auxilio de la técnica de cultivo de tejidos.

MATERIALES Y MÉTODOS 

Se sembraron hojas inmaduras que incluían 2 cm por debajo y 2 cm. por encima de la región apical de la variedad C 127-78 de 6 meses de edad, en medio Payan (5) suplementado con 5 m g/l de 2,4D y 18 % de agua de coco, donde se formaron los callos y para la diferenciación se utilizó el mismo medio pero eliminando los reguladores de crecimiento. 

Encontrándose los callos en R₁ o primer subcultivo, se procedió a la inducción de mutaciones en los mismos, utilizando los mutágenos físicos rayos X y rayos Gamma y el mutágeno químico Azida de Sodio (N_aN₃). 

Las dosis empleadas fueron determinadas en trabajos preliminares, siendo las siguientes:

Rayos X. 80 Kv, 100 Kv, 110 Kv, 120 Kv 
Rayos Gamma (fuente Co 60) : 1000 rad, 2000 rad y 3000 rad 
N_aN ₃: 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05% y 0,1% 

Una vez obtenidas las planticas y contar éstas con el tamaño y cantidad de raíces requeridas, se pasaron a vivero en bolsas de polietileno con tierra y aquí se fueron eliminando a los individuos más afectados por la roya. 

Después de realizada esta selección, se sembraron en el campo los subclones de forma individual con distancias de 0.80 m entre plantas y 1,60 m de camellón; estableciéndose chequeos fitopatológicos mensuales, donde se comparó el comportamiento de los subclones ante la roya con el de la variedad donadora. Se seleccionaron los individuos que se mantuvieron menos afectados que éste, pasando los subclones seleccionados en caña planta a etapa de reproducción con el objetivo de estudiarlos comparativamente con la variedad donadora, la PR980 como testigo altamente resistente y la B 4362 como testigo altamente susceptible. En planta ya los 5 meses de edad, se tomaron observaciones de incidencia de roya (escala de 0 = sana a 4 = altamente susceptible), altura, diámetro y color de los tallos, número de tallos por cepa y longitud de los entrenudos, a fin de caracterizar a los 15 subclones seleccionados. A los 12 meses se midió altura, 8rix, diámetro y número de tallos, procesándose los datos mediante un análisis multivariado y análisis factorial de correspondencia simple.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

Como producto de los chequeos fitopatológicos sistemáticos en condiciones de campo, se efectuó la eliminación de los plantines afectados por roya a los 5 meses de edad, con el objetivo de seleccionar en cada variante los subclones con mayor grado de resistencia. En las variantes tratadas con la N_aN₃ y rayos Gamma (fuente CO⁶⁰) el 100 % de la población presentó grado 4 de la enfermedad en la escala de 5 valores (0-4), no siendo así en la variante tratada con 80 Kv de rayos X, donde fueron seleccionados 15 subclones que presentaron valores 1 y 2 de roya. 

En el cuadro 1 se ofrecen las principales características de los subclones seleccionados, sobre la base de la evaluación fitopatológica y las observaciones realizadas.

Como se puede observar, la variedad donadora presentó valor 4 de roya, al igual que el testigo susceptible B 4362, mientras que el testigo resistente PR 980 presentó valor 2. 

En los subclones seleccionados se presentan variaciones con relación al grosor del tallo, la coloración, la cantidad de tallos por plantón, la presencia de renuevos, así como por el comportamiento específico ante la roya.

A los 12 meses de edad y teniendo en cuenta las variables de altura, Brix, diámetro y número de tallos en cada subclon, se establecieron 5 clases (Cuadro 2), las cuales agrupan a los subclones por la similitud que existe en un carácter dado y mostrando además la variabilidad existente en los otros caracteres. 

La clase I contiene a los subclones 1,11,3,12 y 14, similares en sus características de altura. La clase II contiene a los individuos 2,5 y 8 similares entre sí en la altura, pero superando a la clase anterior. La clase IV, que incluye a los subclones 6,9, 10, 7, 15 y 13, los agrupa por su menor altura de tallos. La clase III separa al subclon 4 por su elevado número de tallos, que lo diferencia del resto de los individuos. La clase V tiene como tal al testigo (donador) que es el individuo 16. 

Debido a que por este método de análisis multivariado, se haría necesario realizar clasificaciones para cada variable y confundiría la selección de los mejores individuos, se realizó un análisis factorial de correspondencia simple (Cuadro 3 ). De este análisis se desprende que la primera componente aporta el 57% de la variabilidad explicada y 41,8% para la segunda componente, dando como resultado que ambos componentes influyen en un 98,8% de la variabilidad.

Al detallar la contribución aportada por cada una de las características estudiadas, se consigue que para la primera componente, el Brix es el que mayor influencia tiene, seguido por el diámetro del tallo. Son entonces los subclones 9 y 15 los mejores individuos, que se separan del resto por su alto grado registrado, con 24,24 y 24,87 o Bx, respectivamente (Cuadro 2), superando a la variedad donadora y al resto de los subclones. En diámetro, los subclones 10,9 y 13 lograron superar a la donadora. La otra variable que influye en esta componente es la altura, aunque en menor grado, con las características señaladas anteriormente en el análisis multivariado. 

La segunda componente esta determinada por el número de tallos por cepa, sobresaliendo los subclones 4 y 11 con 37 y 27 tallos respectivamente y ubicándose en el otro extremo el subclon 7 con apenas 6 tallos

Se consiguió una correlación positiva entre el número de tallos y la altura. 

CONCLUSIONES 

1. Dosis de 80 Kv de Rayos X produjeron variabilidad en los callos de la variedad C 127-78, dando origen a 15 subclones resistentes a la roya de la caña de azúcar. Las otras dosis de rayos X, así como las aplicadas con rayos Gamma y Azida Sódica no dieron resultados en generar resistencia a esa enfermedad. 

2. El comportamiento ante la roya de los subclones mencionados, se mantuvo estable en los 12 meses de observación. El subclon 3 mostró grado 1 y el resto grado 2 de la enfermedad, mientras que la donadora mantuvo grado 4 (altamente susceptible). 

3. Se seleccionaron los dos somaclones más destacados, el 9 y el 15, por su alto contenido de Brix y su resistencia a la roya. Ellos serán propagados para seguir observándoles sus características agronómicas e industriales.

OBTENTION ANO SELEGTION OF RUST RESISTANT SUGAR GANE SUB-CLONS FROM C 127-78 VARIETY BY TISSUE CUL TURE. 

ABSTRACT 

In order to obtain subclons resistant to rust (Puccinia melanocephala H. and P. Sydow) from susceptible sugar cane variety C127-78, pieces of inmature leaves were sowed in a in vitro Payan medium supplemented with 5 mg/l 2,4 -D and 18% coconut water. The callus obtained were treated with physical and chemical mutagens at the following dose: a) 80; 100; 110; and 120 Kv of X Ray. b) 1,000; 2,000 and 3.000 rad of Gamma Ray. c) 0.01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05 and 0.1 % of Sodic Azide (N3 N.). The regenerated plants were carried to nursery and those with severe rust symptoms were eliminated. The rest were planted on the field where the healt status was observed and evaluated by comparing each subclon with giving variety and the controls B4362 (susceptible) and PR980 (resistant) using five degree scale. Fifteen subclons treated with 80 Kv XRay were selected. They showed 1 and 2 rust degree while the giving variety reached 4 rust degree. The remaining subclons were susceptible and therefore discarded. The selected subclons and the variety C127-78 were propagated. At the age 5 months they were described according their susceptibility to rust, and height. diameter and stalk colour, number of stalk per stool and internode length were recorded. At the age of 12 months the characteristics of height. diameter, number of stalk and Brix were measured. The subclon number 3 showed 1 rust degree and the others 2 rust degree, while the variety mantained 4 rust degree (highly susceptible). The subclons 9 and 15 were selected because their high Brix content and rust resistance. 

BIBLIOGRAFÍA 

1. CORNIDE, M.T. 1975. Aplicación de la inducción de mutaciones al mejoramiento gen ético. Centro de Información y Documentación Agropecuaria 2 (10-11):2-61. La Habana, Cuba. 

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