Veterinaria Tropical. 1: 79-87. 1976

RESULTADOS COMPARATIVOS DE CINCO MÉTODOS DE DIAGNOSTICO 
DE LA BRUCELOSIS

ANÍBAL BELLO N.*, PEDRO MOGOLLÓN* y HEDDY MARTÍNEZ *

*CENIAP. Instituto de Investigaciones Veterinarias
Sección de Microbiología y Patología
Apdo. 70, Maracay, Venezuela

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una de las zoonosis de mayor importancia en la América Latina, estimando SZYFRES (9) que su incidencia en la especie bovina ocasiona pérdidas anuales de 1.100 millones de bolívares en la región, de los cuales 67,4 millones corresponden a Venezuela (Villegas, M. Comunicación Personal).

La tasa de infección a nivel nacional es estimada en 7,44 % de la población bovina del país, con un rango que va de 4,3 % en el Estado Lara a 25 % en el Estado Zulia (Trujillo, R. Comunicación Personal).

El Ministerio de Agricultura y Cría, a través del Departamento de Tuberculosis y Brucelosis, ha venido utilizando la prueba de seroaglutinación en placa como método de diagnóstico rutinario.

Esta prueba junto con la de seroaglutinación en tubos, es de extraordinario valor como método de detección de la brucelosis; sin embargo, según OLITZKI (7) ambas pruebas tienen limitaciones en presencia de sueros con bajos títulos debido a infecciones, post-vacunaciones y reacciones inespecíficas.

El objetivo de este trabajo fue analizar los primeros resultados obtenidos en el diagnóstico de la brucelosis bovina, aplicando, además de las pruebas convencionales en placa y en tubos, las pruebas complementarias del rivanol (RIV), mercaptoetanol (ME) y fijación de complemento (FC) .Las pruebas complementarias, como lo informa la Memoria y Cuenta del Ministerio de Agricultura y Cría, 1970 (5), comenzaron a ser utilizadas en Venezuela a fines de ese año, con el objetivo de intentar el esclarecimiento de las dificultades que conlleva el diagnóstico de la brucelosis, especialmente en aquellos animales catalogados como dudosos con las pruebas de seroaglutinación en placa y en tubos, la mayoría de los cuales son eliminados de acuerdo a los artículos 13, 14 y 15 de las Normas para la Campaña de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina, de fecha 16-8-68.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se estudiaron 1.791 sueros de bovinos, procedentes de 754 animales vacunados con Brucella abortus cepa 19 y de 1.037 animales no vacunados. La mayoría de estas muestras fueron enviadas por el Departamento de Tuberculosis y Brucelosis del Ministerio de Agricultura y Cría, por intermedio de sus Oficinas de Fomento y Sanidad Animal. Las restantes fueron obtenidas de animales pertenecientes a estaciones experimentales dedicadas a la investigación en producción animal.

Los sueros se conservaron en congelación a -20ºC. antes de ser procesados.

Seroaglutinación en Placa (SP) y en Tubos (ST)

Se utilizaron métodos convencionales y antígenos standard elaborados por el Instituto de Investigaciones Veterinarias.

Prueba de Rivanol (RIV)

Se usó antígeno específico y solución de rivanol al 1 % obtenidos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, por intermedio de la Oficina Sanitaria Panamericana, Caracas. Para la aplicación de este método se siguieron las instrucciones contenidas en el Manual del Centro Panamericano de Zoonosis (2). Los títulos a partir de 25 U. I. se consideraron como significativos.

Prueba del Mercaptoetanol (ME)

Siguiendo las instrucciones del Manual del Centro Panamericano de Zoonosis (2), en filas de 4 tubos (100 x 13), se colocaron las siguientes cantidades de sueros: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 ml. Luego se añadió a cada uno de ellos 1 ml. de mercaptoetanol 0,l M. Después de una hora a temperatura ambiente, se agregó a cada tubo, 1 ml de antígeno para prueba en tubos a doble concentración (0,09 %). La lectura se efectuó a las 44 horas. Esta prueba se montó simultáneamente con la prueba de seroaglutinación en tubos. Los títulos obtenidos a partir de 25 U. I. se consideraron significativos.

Prueba de Fijación de Complemento (FC)

Se hizo de acuerdo a la técnica de ALTON y JONES (1) y Prueba de Fijación de Complemento (2), basada en la fijación en frío y 100 % de hemólosis. Se utilizó el antígeno para prueba en tubos, diluido 1/400; dos unidades de complemento y hemolisina comercial diluida 1/4000. El suero patrón internacional diluido 1/24 fija el complemento en la dilución 1/10 en la técnica empleada. Se consideraron como significativos los títulos 1/10 o superiores, para los animales vacunados y 1/5 o superiores para los no vacunados.

RESULTADOS

En el Cuadro 1 se presentan los resultados obtenidos en 1.037 sueros de bovinos no vacunados, examinados con los métodos de seroaglutinación en placa (SP) y con las pruebas complementarias.

Puede constatarse una mayor especificidad y sensibilidad de las pruebas complementarias, ya que comparadas con las pruebas convencionales, redujeron notablemente el número de muestras dudosas a 5 (0,48 %) y aumentaron las positivas a 218 (21,02 %) y las negativas a 814 (78,50 %). Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por LAMBERT y AMERAULT (4), NAGY y SORHEIM (6) y PAVLAS y MONET (8).

En cuanto a la prueba en tubos, su utilización produjo una disminución del número de muestras positivas y dudosas y un aumento de las negativas, demostrando que es más específica pero menos sensible que la prueba en placas.

Los resultados que aparecen en el Cuadro 2, proceden de los 1.037 sueros de bovinos no vacunados antes citados. Esos sueros fueron probados con cada uno de los métodos de diagnóstico de la brucelosis utilizados en este trabajo.

Examinando el grupo de 163 muestras positivas con la prueba en placa, se observa que la aplicación de las pruebas complementarias impide la eliminación de 29 animales (columna "negativas rivanol").

En el grupo de 376 animales dudosos con la técnica en placa, las pruebas complementarias clarificaron la situación, al obtenerse 306 muestras negativas (81,38 %) y positivas (18,62 %), al utilizar la prueba del mercaptoetanol.

Con respecto a las 498 muestras con la prueba en placa, de no haberse empleado las complementarias, dos animales hubiesen quedado como negativos a pesar de ser positivos (columna "positivas fijación de complemento"). En el Cuadro 3 se presentan los resultados obtenidos con los sueros de bovinos vacunados con Brucella abortus cepa 19. Puede observarse que las pruebas complementarias siguieron comportándose como más específicas y sensibles. En cuanto a la prueba en tubos, en el grupo de animales positivos esta técnica mostró mayor especificidad y sensibilidad que la prueba en placa, lo que no sucedió en el grupo de animales no vacunados, en los cuales el método en placa fue más sensible.

En el Cuadro 4 se presentan los resultados de un estudio comparativo similar al relatado a propósito del Cuadro 2.

Puede observarse en el grupo de 86 animales positivos con la técnica en placa, que la aplicación de las pruebas complementarias evitó que 7 de ellos (8,14 % ) fueran eliminados (columna "negativas rivanol"). Sin embargo, la prueba en placa mostró más especificidad en los animales vacunados que en los no vacunados.

En el grupo de 111 animales catalogados como dudosos con el método en placa, las pruebas complementarias aclararon la situación, al resultar 61 bovinos positivos (54,95 %) y 50 negativos (45,5 %), a utilizar la prueba del rivanol. La aplicación única de la prueba en tubos en este mismo grupo, hubiese conducido a la eliminación de 4 animales tenidos como positivos que realmente eran negativos (columna "negativa rivanol"), y dejado en las fincas como negativos a 15 bovinos positivos (columna "positivas rivanol").

En los 557 animales que resultaron negativos con la técnica en placa, las pruebas complementarias evitaron que 13 bovinos (2,33 % ) quedasen falsamente como negativos (columna "positivas mercaptoetanol y fijación de complementos").

DISCUSIÓN

El análisis de los resultados obtenidos en este trabajo permite ratificar que en el diagnóstico de la brucelosis, las pruebas complementarias son más específicas que las de seroaglutinación en placa y en tubos, tanto en animales vacunados como no vacunados. Las pruebas complementarias no sólo son de inestimable valor para clarificar la situación de los animales catalogados como dudosos con las pruebas complementarias, sino también la de aquellos clasificados como positivos y negativos. Como ya se observó, de no haber sido utilizadas estas pruebas, muchos animales hubiesen sido eliminados como positivos, cuando en realidad eran negativos y más aún, bovinos realmente positivos, hubiesen permanecido en las fincas como negativos.

De las pruebas complementarias utilizadas en animales no vacunados, la técnica del mercaptoetanol fue de mayor especificidad y sensibilidad que las de rivanol y de fijación de complemento. En animales vacunados, la prueba del rivanol fue la más específica y sensible. La prueba de seroaglutinación en tubos deberá reemplazar a la prueba en placa. como método de diagnóstico en el campo, a medida que las circunstancias lo permitan y en áreas donde estén realizando campañas de erradicación, deben utilizarse las pruebas complementarias junto con las pruebas convencionales, con el objeto de determinar las fincas libres de brucelosis. Ello evitará el error de dejar animales positivos dados como negativos con las técnicas convencionales y de sacrificar animales negativos dados como positivos.

Sería recomendable iniciar nuevas investigaciones, a fin de incorporar otros métodos de diagnóstico, fundamentalmente aquellos utilizados para detectar anticuerpos incompletos, los cuales no son evidenciados con los métodos utilizados en este trabajo.

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen la colaboración de los Dres. Roberto Alvarez, Martín Barroeta y Carlos Marín, por haber revisado el manuscrito y las sugerencias que sobre él emitieron. A las Srtas. Carmen Regueiro y Clemencia Carrasquero, por su valiosa colaboración en el trabajo de laboratorio.

RESUMEN

Se examinaron 1.791 sueros de bovinos, procedentes de 754 animales vacunados con Brucella abortus cepa 19 y de 1.037 animales no vacunados.

Las pruebas complementarias: Rivanol (RIV), Mercaptoetanol (ME) y Fijación de Complemento (FC), demostraron ser más específicas que las pruebas convencionales de seroaglutinación en placa (SP) y en tubos (ST), tanto en los animales vacunados como en los no vacunados, no solamente en aquellos catalogados como dudosos con estas últimas, sino también en los grupos de animales clasificados como positivos y negativos.

Se recomienda el uso de las pruebas complementarias, principalmente en muestras procedentes en áreas que se encuentren en proceso de erradicación de la enfermedad y de animales que tengan un gran valor genético.

La prueba seroaglutinación en tubos deberá reemplazar a la prueba en placa como método de diagnóstico en el campo, a medida que las circunstancias lo permitan.

SUMMARY

One thousand and seven hundred and ninty nine (1971) bovine serum samples, obtained from 754 animals vaccinated with Brucella abortus strain 19, and (1037) non vaccinated animals, were examined.

The complementary test: Rivanol (RIV), Mercaptoethanol (ME), and Complement Fixation (CF), showed to be more specific and accurate than the conventional methods: Plate Agglutination (PA) and Tube Agglutination (TA) test, when applied to those animal classified either as suspicious, positive or negative.

It is recommended the use of the complementary tests for those serum samples which are obtained from areas in process of erradication of the diseasse and from those animals that have a great genetic value.

The tube agglutination test should replace the plate test as a field diagnosis method, as the circunstances make it possible.

BIBLIOGRAFÍA

1. ALTON. G. G. and JONES, L. M. Laboratory Techniques in Brucellosis. World Health Organization, Geneve. Monograph Series, Nº 55. 1967. 92 p .

2. CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS. Pruebas Complementarias para el diagnóstico serológico de la brucelosis. Buenos Aires, 1970. 16 p .

3. JOINT FAO/WHO. Expert Committee on Brucellosis. Fifth Report. 1971. 76 p.

4. LAMBERT, G. and AMERAULT, E. Comparative study of three serogic test for detecting the response in cattle to virulent Brucella Amer .J .Vet .Res. 23: 529-533. (1962) .

5. MINISTERIO DE AGRICULTURA y CRÍA, VENEZUELA. Memoria y Cuenta 1970. Caracas. pp. 128-132. (1971) .

6 .NAGY, L .K. and SORHEIM, A. O. A. Survey of Brucella infecton of cattle in Kenya. A comparison of four serological test for the diagnosis of infection. Vet. Rec. 84. 65-67. (1969) .

7 .OLITZKI, A. Inmunological methods in brucellosis research .Part I. In vitro procedures. New York, S. Karger. 1970. 249 p.

8. PAVLAS, M. and MONET. V. M. Experiencias y resultados en el diagnóstico del laboratorio en la brucelosis. Rev. Cub. Cien. Vet. 1. 83-100. (1970).

9. SZYFRES, B. Situación report on brucellosis in Latin America. Pan American Zoonoses Center, Buenos Aires. 1968. 15 p.