Veterinaria Tropical 13: 55-67.1988

*FONAIAP. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Instituto de Investigaciones Veterinarias. Aptdo. 70. Maracay. 2101. Venezuela.
**Universidad Central de Venezuela- Facultad de Ciencias.
Centro de Biología Celular. Caracas 1020. Venezuela

Recibido: mayo 15. 1 989.

RESUMEN 

Con la finalidad de conocer la relación entre la naturaleza transmisible de la resistencia a los antimicrobianos, producción de K88 y toxina termoestable tipo "a" (TSa), se analizaron 61 cepas de E. coli aisladas de cerditos con diarrea. El 18% de las cepas fueron K88 positivos (K88⁺), 20% TSa positivas (TSa⁺) y 5% expresaron en forma simultánea ambos determinantes. El 45% de las cepas K88⁺, 17% TSa⁺ y 67% K88⁺ TSa⁺ estuvieron ligadas a plásmidos autotransferibles pertenecientes a los grupos de incompatibilidad FV (80%) y FIV (20%). Todas las cepas transfirieron resistencia a estreptomicina y triple sulfa. Estos resultados sugieren que las características mencionadas (resistencia, K88 y TSa) en las cepas de E. coli porcino analizadas son transportadas en un mismo plásmido. Este proceso se ve favorecido por el uso difundido de los antimicrobianos en la cría porcina, permitiendo un incremento selectivo de E. coli entero patógeno en el ambiente. 

INTRODUCCION 

La diarrea en lechones en el período neonatal y post-destete representa un serio problema económico para la ganadería porcina. La diarrea en su origen se debe a causas infecciosas y no infecciosas que frecuentemente actúan juntas o en secuencias. Escherichia coli enteropatógena es el agente bacteriano más implicado en este proceso infeccioso por su habilidad de colonizar el intestino delgado del huesped susceptible y producir exterotoxinas (1,7.18,19). 

La capacidad de E. coli de adherirse y colonizar el intestino delgado, sobrepasando los mecanismos de motilidad intestinal, está asociada a la presencia de apéndices de naturaleza proteica denominados fimbrias de adherencia, reportándose a K88 como la más aislada frecuentemente en cerdos y su presencia se ha asociado a la producción de toxina termoestable, termolábil o ambas (8,17). 

 Todas las cepas de E. coli enteropatógena son capaces de producir una toxina termoestable o una termolábil o ambas. Estas determinan un aumento de la secreción intestinal una vez que el microorganismo se ha adherido a las células del epitelio intestinal (7,17).

 Los antimicrobianos han sido frecuentemente utilizados en el tratamiento de este tipo de infecciones. Sin embargo, su uso se ha visto limitado por la aparición de cepas bacterianas resistentes (13,30,31).

 La producción de enterotoxinas y fimbrias de adherencia por cepas de E. coli así como su habilidad a desarrollar resistencia es controlada por plásmidos transmisibles e independientes, pero existe información sobre cepas de E. coli enterópatógenas de origen humano y animal, en los cuales los genes para cada factor pueden estar presentes en un mismo plásmido (5, 11, 24, 28). 

El objetivo de este trabajo fue reconocer la relación que podría existir entre estos plásmidos y reconocer cuales determinantes de resistencia (A) podían ser contransferidos junto a K88 y TSa en cepas de E. coli aisladas de lechones con síndrome diarréico. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Cepas Bacterianas

Sesenta y una cepas de Escherichia coli fueron aisladas del intestino delgado de lechones con diarrea, las cuales se caracterizaron siguiendo la metodología descrita por Edwards y Ewing (6). La edad de los lechones oscilaba entre una a cinco semanas, provenientes de diferentes granjas porcinas de la región central del país. Estas cepas fueron portadoras del fenotipo lactosa positiva y sensibles al ácido nalidixico (lac⁺; NaI^S).     

Como cepa auxótrofa receptora fue utilizada una cepa de E. coli K 12711 cuyos requerimientos son prolina, histidina y triptofano portadora del fenotipo lactosa negativa y resistente al ácido nalidixico (lac^-, Nai^r). 

Todas las cepas identificadas como E. coli y sus transconjugantes fueron analizadas en su capacidad de producir K88, toxina termoestable "a" (TSa) y susceptibilidad frente a 14 antimicrobianos. Los plásmidos utilizados y su origen se describen en el Cuadro 1. 

Detección de K88

Se realizaron pruebas de aglutinación en lámina colocadas en presencia del antisuero polivalente K88 según metodología descrita por Edwars y Ewing (6). 

Detección de toxina termoestable tipo "a" (TSa)

Para ello se utilizó la prueba de ratón lactante descrita por Dean et al. (4). Pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos. Se estudió la susceptibilidad de las 61 cepas de E. coli aisladas y sus transconjugantes frente a 14 antimicrobianos según la metodología descrita por  Bauer y Kirby (2). Los antimicrobianos utilizados y sus concentraciones fueron ácido nalidixico, AN (30 mcg); ampicilina, Am (10 mcg); cefalotin Cf (30 mcg); colistin, CI (10 mcg); cloranfenicol, Cn (30 mcg); gentamicina, Gm (10 mcg); kanamicina, Km (30 mcg); neomicina, Nm (30 mcg); nitrofurantoin, Nf (300 mcg); polimixin B, pB (300 unit); estreptomicina, Sm (10 mcg) ; tetraciclina, Tc (30 mcg); trimetropin-sulfametoxazole, Tsx (25 mcg) y triple sulfa, Ts (300 mcg). 

Experimentos de conjugación

La conjugación se realizó en medio sólido a 30°C, bajo las condiciones descritas por Rodríguez -Lemoine y Rowbury (22). Las cepas de E. coli salvajes (lac⁺, NaI^S) fueron utilizadas como donantes y la cepa de E. coli K 12711 lactosa negativa y ácido nalidíxico resistente (lac^-, Nal1 como receptora. La mezcla de conjugación fue incubada a 30°C por dos horas y la selección de transconjugantes se realizó en placas de agar medio mínico suplementado con los requerimientos nutricionales de la receptora, adicionado de ácido nalidixico a una concentración final de 40 mcg/ml y el antimicrobiano por cuyo determinante de resistencia se iba a seleccionar; en cada caso se seleccionó por cinco antimicrobianos cuya concentración final fue para Am, Cn y Kn 20 mcg/ml; Sm 30 mcg/ml y Tc 15 mcg/ml, 

La frecuencia de transmisión fue expresada como el número de transconjugantes resistentes que desarrollaron colonias en las placas de selección después de 48 horas de incubación, divididas entre el número de donantes viables en la mezcla de conjugación. Las transconjugantes fueron aisladas por agotamiento en ausencia de presión selectiva; posteriormente se determinó el fenotipo de los plásmidos transferidos.

Clasificación de los plásmidos aislados por incompatibilidad

Se realizó una clasificación preliminar de los plásmidos presentes según su capacidad de expresar el carácter de inhibir la fertilidad de un factor F (fi⁺) según las condiciones descritas por Rodríguez-Lemoine, (23).

Los plásmidos que expresaron el carácter fi⁺ fueron luego clasificados por incompatibilidad (3). Las cepas transconjugantes construidas por introducción de los plásmidos transmisibles se utilizaron como donantes con cada una de las cepas receptoras. Como receptoras fueron usadas cepas de E. coli portadoras de plásmidos del tipo F grupos de incompatibilidad FI, FII, FIV y FV. La conjugación se realizó siguiendo la misma técnica descrita. La selección de transconjugantes se hizo por aislamiento de 16 clones en agar deoxicolato. La coexistencia estable y hereditaria de los plásmidos entrantes y residentes fue continuamente analizada en ausencia de presión selectiva. 

RESULTADOS 

Producción de fimbrias K88 y de toxina termoestable tipo "a"

Once cepas (18%) codificaron para K88 y exhibieron resistencia múltiple a los antimicrobianos (Cuadro 2). Se demostró la toxigenicidad (TSa) en 12 cepas (20%) y fue observada la producción simultánea de TSa y K88 en tres cepas (5%) (Cuadro 2). 

Susceptibilidad a los antimicrobianos

Todas las cepas K88⁺ y TSa⁺ mostraron resistencia múltiple a los antimicrobianos, exhibiendo resistencia mínima a tres antimicrobianos y como máximo once. Se determinaron 17 patrones de resistencia diferentes. Todas estas cepas fueron resistentes a Sm, Tc y Ts. Se observó menor frecuencia de resistencia para CI y pB; ninguna de las cepas fue resistente a Gm y An (Cuadro 3).

 Transmisibilidad de los determinantes de resistencia y virulencia Identificados

La naturaleza plasmídica de estos determinantes se estableció por experimentos de conjugación. E145% de las cepas de E. coli K88⁺, 17% de las cepas TSa⁺ y e167% productoras simultáneas de K88 y TSa estuvieron ligadas a plásmidos autotransferibles con frecuencias que oscilaron entre 0,02 x 10^-4 a 0,2 x 10^-2. Todas las cepas K88⁺ y TSa⁺ transfirieron para Sm y Ts (Cuadro 4). 

Clasificación de los plásmidos por pruebas de Incompatibilidad

 Las cepas fi⁺ que transfirieron resistencia, K88 y TSa fueron portadoras de cuatro plásmidos pertenecientes al grupo FV I lo cual representa e180% de todas las transconjugantes analizadas y un plásmido al grupo FIV que viene a representar un 20% del total (Cuadro 5).     

     
DISCUSIÓN

Los resultados del presente estudio demuestran que e1 20% de las cepas de E. coli  productoras de TSa y el 18% productoras de K88 fueron a su vez multiresistentes cuando se probaron frente a 14 antimicrobianos manteniendo estable la resistencia para Sm, Tc y Ts, lo cual coincide con los datos mencionados anteriormente. 

Los dos mayores determinantes de virulencia de E. coli enteropatógena son producción de enterotoxinas y fimbrias de adherencia. Estas son codificadas por plásmidos transmisibles, aunque generalmente los genes que los determinan se ubican en plásmidos distintos y diferentes de los que codifican resistencia (7,27). Sin embargo, hay cepas de E. coli de origen humano y animal donde los genes que codifican para enterotoxinas y resistencia a los anti- microbianos pueden hallarse en un mismo plásmido (5,10,11). También se ha encontrado en este tipo de cepas plásmidos codificando adherencia y resistencia a la vez (11,21 ). 

En el presente estudio se demuestra la naturaleza plasmídica de la multiresistencia, de la producción de TSa y K88 en forma simultánea manteniéndose una resistencia constante para Sm y Ts. 

La cotransferencia de resistencia, exterotoxigenicidad y adherencia puede ser debida a la presencia de  tres  clases  de   plásmidos (R-K88- TSa) que se están transfiriendo simultáneamente, o que los genes que codifican estos determinantes son transportados por un mismo plásmido, lo cual puede ocurrir por el mecanismo de transposición (16,18), más aún si tomamos en cuenta la naturaleza transponible de los genes de toxina termoestable como parte del transposon 1681 (25,26) o por eventos de recombinación entre plásmidos, como el reseñado por Echeverria y Murphy (5) entre un plásmido Ent y un plásmido R portador de resistencia para estreptomicina, sulfisoxazole y tetraciclina, en una cepa de E. coli aislada de un caso de diarrea infantil.

Las observaciones de este estudio sugieren que el uso difundido de los antibi6ticos en la poblacj6n porcina puede incrementar la distribuci6n de E. co1i enteropatógena en el ambiente debido a la presencia de cepas portadoras de plásmidos Ent-R-K88 lo que confiere una ventaja selectiva de estas cepas en la poblaci6n porcina, manteniéndose un  E. co1i altamente pat6geno en el ambiente. 

SUMMARY 

A study was carried out in order to know the relation ship among the transmisible nature of multiresistance to antimicrobial agents, the production of K88 and the heat stable enterotoxin (Sta) in 61 Escherichia co1i strains isolated from diarrheic piglets. The 18% of strains produced K88 (K88⁺), 20% Sta (Sta⁺ and 5% expresed both markers. The 45% of  K88⁺, 17% Sta⁺ and 67% (Sta⁺) Sta⁺ strains were produced by conjugative plasmids belonging to compatibility groups FV (80%) and RV (20%). It was determined that a basic stable resistance pattern (Sm- Ts) was linked to these conjugative plasmids. The present report described the ocurrence of genes for colonization fimbria (K88), resistance to antimicrobial agents and Sta probably on a single plasmid in porcine Escherichia co1i strains. This event may be due to a strong selective pressure by a irrational usage of antimicrobial agents in porcine farms. 

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