Veterinaria Tropical. 15: 39-55. 1990

OBTENCI�N DE UNA VACUNA INACTIVADA OLEOSA CONTRA EL VIRUS 
NEW JERSEY DE ESTOMATIS VESICULAR¹

Jes�s Casta�eda G.*

¹ Trabajo realizado como parte del Proyecto S1-2048, financiado por el Consejo Nacional de
Investigaciones Cient�ficas y Tecnol�gicas (CONICIT),
conjuntamente con el Fondo Nacional de Investigaciones Agropecuarias.
Para este producto ha sido solicitada la patente de invenci�n correspondiente.
*Profesor Agregado de la Universidad Central de Venezuela en la
Facultad de Ciencias Veterinarias.
 Investigador V. Jubilado del FONAIAP
 
Recibido: Diciembre 12, 1990.

RESUMEN 

 Se desarroll� una vacuna inactivada contra el virus New Jersey de estomatitis vesicular, Esta vacuna mostr� estabilidad de por lo menos un a�o, guardada a temperatura de refrigeraci�n. El contenido virar de los lotes de vacuna producidos fue de 10^7.4 a 10^8.2DI^50% y los t�tulos antig�nicos determinados por fijaci�n de complemento cuando las vacunas fueron elaboradas, y despu�s de un a�o de almacenamiento, cuando se procedi� a la ruptura de la emulsi�n, indican una muy buena estabilidad antig�nica de las mismas. La vacuna fue aplicada en 90 bovinos de diferentes edades mantenidos en condiciones de campo y produjo buena respuesta inmune seg�n se desprende de los altos t�tulos de anticuerpos, determinados por el m�todo de ELISA indirecto. El esquema de vacunaci�n utilizado para bovinos de diferentes edades parece ser aconsejable para el control de la estomatitis vesicular .

 INTRODUCCI�N 

La estomatitis vesicular es una enfermedad viral que ataca a varias especies de mam�feros dom�sticos y salvajes, y tambi�n al hombre, por lo cual es considerada como una zoonosis. Se encuentra distribuida en todos los pa�ses del continente americano desde Per� hasta los Estados Unidos (8, 9) donde causa p�rdidas considerables a las ganader�as bovina y porcina (6).  

Se han realizado esfuerzos para desarrollar vacunas eficaces que permitan el control de esta enfermedad. Entre estas vacunas se encuentran las desarrolladas por Lauerman et al. (11, 12, 13), las cuales fueron elaboradas a partir de virus vivo modificado por pases seriados en embriones de pollo, y luego el virus vacunal era producido en este mismo substrato. Las experiencias de vacunaci�n de ganados con esta vacuna en Wisconsin y Georgia (USA), Panam�, Ecuador y Guatemala fueron revisadas por Lauerman y Hanson (14). 

Desde 1971 se utiliz� en Venezuela una vacuna a base de virus vivo modificado mediante pases seriados en ratones, huevos embrionados y cultivos celulares, la cual fue desarrollada por Casta�eda (3) y Casta�eda et al. (4). Esta vacuna se presentaba en forma l�quida como una suspensi�n de virus en soluci�n tamponada de fosfatos con 40% de glicerina, para aplicaci�n intramuscular en bovinos, porcinos y equinos, y se aplic� extensivamente hasta mediados de 1990, con una producci�n anual de 700.000 a 1.000.000 de dosis.

 Se han producido vacunas a base de virus inactivado, adicionadas de adyuvantes, como las desarrolladas por Correa (7) utilizada a escala experimental en Guatemala. Lauerman et al. (15) informaron sobre el desarrollo de una vacuna inactivada contra estomatitis para ser utilizada en los Estados Unidos, en programas de emergencia por brotes de la enfermedad. 

Por su parte Yilma et al. (18) informaron sobre la respuesta inmunitaria de bovinos y ratones cuando fueron vacunados con una vacuna elaborada con Glicoprote�na G. extraida del virus de estomatitis vesicular tipo New Jersey. 

En este trabajo se presentan los resultados obtenidos en bovinos con una vacuna inactivada contra estomatitis vesicular, elaborada con virus tipo New Jersey adaptado y producido en cultivo celular, luego inactivado y adicionado de adyuvante oleoso. 

MATERIALES Y M�TODOS

Virus

 Despu�s de probar varias cepas de virus tipo New Jersey, se seleccion� una de origen porcino que se adapt� completamente en cultivos de C�lulas BHK₂₁ clon 13, por pases alternos en monocapas y en suspensi�n, la cual se mantuvo estable en cuanto a la producci�n de ant�genos (cosechas) con t�tulos infecciosos adecuados. Esta cepa de virus constituye la semilla maestra y se identific� como VEV-NJ-Proyecto S1-2048. De esta semilla se ha producido un limitado n�mero de pases los cuales son utilizados como semilla de producci�n. 

La semilla de producci�n se utiliz� para la elaboraci�n de ant�geno (cosechas) para las vacunas y tambi�n para la producci�n de stocks de virus, que una vez concentrado y purificado, seg�n el procedimiento descrito McSharry et al. (16), es utilizado para las pruebas de ELISA Indirecto en la evaluaci�n de la respuesta inmune en bovinos vacunados. 

Producci�n de ant�geno

 Con la semilla de producci�n (no m�s de cinco pases de la semilla maestra) se inocularon frascos rotatorios (rollers), frascos de Roux o cultivos en suspensi�n de c�lulas BHK₂₁ clon 13; se adicionaron de medio de Eagle de mantenimiento y luego se incubaron durante unas 24 horas, hasta la producci�n de cerca del  100% de efecto citop�tico. Estos cultivos fueron puestos en congelaci�n, entre -15�C y -20�C, hasta el momento de la inactivaci�n. 

Antes de la inactivaci�n, los frascos fueron descongelados, despu�s se hizo un pool y se someti� acentrifugaci�n durante 15 minutos, a 3.000rpm. Se recolect� el sobrenadante, del cual fueron enviadas muestras al  laboratorio de serolog�a para pruebas de pureza y t�tulo serol�gico por fijaci�n de complemento. Tambi�n se tom� una muestra para determinar t�tulo infeccioso en cultivos celulares o ratones lactantes, y para prueba de esterilidad en los medios bacteriol�gicos: caldo simple, tioglicolato y sabouraud.

 Inactivaci�n del antigeno

 Conocido el resultado satisfactorio de las pruebas de control antes mencionadas, se procedi� a la inactivaci�n del ant�geno por adici�n de B-propiolactona para una concentraci�n final de 1/4.000. 

Veinticuatro horas despu�s de inactivado el virus y mantenido en refrigeraci�n, fueron tomadas muestras para pruebas de inocuidad en aproximada- mente cien ratones ractantes, de 4-6 d�as, los cuales se inocularon por v�a intraperitoneal y fueron observados por siete d�as. Todo rat�n que mor�a, despu�s de 48 horas de haber sido inoculado, se enviaba aserolog�a para detecci�n de virus. 

Formulaci6n y elaboraci�n de la vacuna

 La vacuna fue preparada con un 50% de  ant�geno inactivado y un 50% de un adyuvante oleoso compuesto por un 89,5% de Marcol 52, un 9,5% de Montanide 888 y un 1% de Tween 80. Para el proceso de mezcla y emulsificaci�n se utiliz� un emulsificador  JANKE KUNK EL, IKAWERK, ULTRA- TORRAX Modelo SD-45 de TEKMAN COMPANY. Tanto el  ant�geno corno el adyuvante se mantuvieron a baja temperatura para evitar el calentamiento durante la homogeneizaci�n.

Control de calidad de la vacuna

 Para los controles de calidad de la vacuna terminada se siguieron, en general, los procedimientos recomendados por el Centro Panamericano de Fiebre Aftosa -OPS-OMS-BID, para el control de calidad de las vacunas oleosas contra fiebre aftosa: 

a) Control de esterilidad bacteriol�gica, en medios de caldo triptosa, trioglicolato y sabouraud.

 b) Control de inocuidad, en al menos cien ratones lactantes, igual como se hizo con el ant�geno inactivado. 

c) Control del tipo de emulsi�n, referido a una emulsi�n primaria como es esta vacuna. Se realizaron las pruebas de gota, conductividad, centrifuga y estabilidad. La prueba de estabilidad de la emulsi�n (vacuna) se hace sobre muestras guardadas en refrigeraci�n, a temperatura ambiente ya 37�C por per�odos de un a�o, dos meses y quince d�as, respectivamente. 

d) Control de estabilidad antig�nica. Con el fin de determinar la caducidad de estas vacunas, se guardaron muestras de cada lote de vacuna a temperaturas de refrigeraci�n {4-6�C), durante un a�o. 

Al cumplirse este tiempo, a la muestra de cada lote se le rompi� la emulsi�n, y la fase acuosa resultante, correspondiente al ant�geno, fue enviada al Laboratorio de Serolog�a para estudios de identidad y t�tulo serol�gico por fijaci�n de complemento.

Controles de inmunidad a nivel de campo, por evaluaci�n de anticuerpos circulantes

Para estas pruebas se utilizaron noventa bovinos agrupados en cuatro grupos etarios, los cuales recibieron vacunaciones con dosis de 4 ml de vacuna por v�a intramuscular en el cuello y observados luego durante un a�o, con sangr�as mensuales. La distribuci�n de estos animales seg�n edades y el cronograma de vacunaciones y sangr�as, fue el siguiente: 

a) Grupo uno. Compuesto de veinte bovinos de edades comprendidas entre 6 y 12 meses, los cuales fueron identificados, sangrados y vacunados por primera vez el 3 de septiembre de 1989, luego sangrados mensualmente y revacunados a los tres, seis y doce meses despu�s de la primera vacunaci�n. 

b) Grupo dos. Conformado por veinte bovinos con edades de 2 a 3 a�os, los cuales fueron identificados, sangrados y vacunados junto con el grupo 1, luego sangrados mensualmente y revacunados a los seis y los doce meses despu�s.

c) Grupo tres. Integrado por veinte bovinos mayores de 4 a�os, identificados, sangrados y vacunados en la misma fecha del grupo anterior y luego sangrados mensualmente y revacunados a los ocho meses y los doce meses despu�s. 

d) Grupo cuatro. Constituido por treinta animales de las tres edades seleccionadas en los grupos anteriores, que no fueron vacunados sino a los ocho meses de iniciado el experimento, pero sangrados mensualmente.

 Los sueros eran procesados y guardados en congelaci�n hasta que se realizaran las evaluaciones de anticuerpos correspondientes por el m�todo de ELISA indirecto (10, 17) o por una prueba directa modificada de fijaci�n de complemento (1) utilizada por microt�cnica, en placas pl�sticas de 96 huecos con fondo en V, para fines de comparaci�n de ambas t�cnicas, en los sueros obtenidos hasta el tercer mes post-vacunaci�n.

M�todo de ELISA indirecto

El procedimiento utilizado para esta prueba fue el siguiente: se tapizaron placas de microt�cnica de 96 vasos (LIMBRO- TITERTEK 76-381-04), cada uno con 100 m l de una diluci�n apropiada de ant�geno (previamente titulado en bloque contra el conjugado utilizado y sueros positivos, negativos y diluente) en tamp�n de carbonato bicarbonato pH 9,6* (*Buffer Carbonato -bicarbonato (buffer de bloque�) pH 9,6: 1 ,59 g de Na₂CO₃; 2,938 de NaHCO₃; 2,0 g de NaN₃ (�cida s�dica), completando hasta 1 litro con H₂O destilada y guardarla a 4 �C por no m�s de dos semanas. ); se incubaron durante una hora a temperatura ambiente y luego a 4�C durante la noche. 

Las placas se lavaron dos veces con PBS -Tween pH 7 ,4 ** (**PBS -Tween pH 7,4: 8,0 g NaCI; 0,2 g KH PO₂; 2,9 g Na₂H PO4 -12H₂O; 0,2 g Kce; 0,5 ml Tween 20, Completar a un litro con agua destilada. El pH final es de 7,4- guardar a 4�C. ) luego se bloquearon con 100 m l por vaso de PBS -Tween con 1% de gelatina blanca (GB) a temperatura ambiente por una hora. 

Fue retirada la soluci�n de bloqueo y se colocaron en cada vaso de las muestras de suero problema en las diluciones deseadas (2 vasos por diluci�n) en PBS -Tween + 1% GB, y se incub� una hora a temperatura ambiente.

Se lavaron las placas tres veces con PBS -Tween y se agregaron 100 l por vaso de anti IgG bovina conjugada con peroxidasa de r�bano picante, �ptimamente diluida en PBS -Tween + 1% de GB. Se mantuvo una hora a temperatura ambiente. Luego fue lavada nuevamente con PBS -Tween y se le agregraron 100 m l de substrato de ortofenildiamina (OPD) a cada vaso.

Las placas se mantuvieron por cinco a diez minutos a temperatura ambiente y luego fue frenada su reacci�n con 50 m l H₂SO₄ 1M. 

La absorbancia se midi� en espectrofot�metro Titertek Multiskan a 492 nm. En todos los ensayos de ELISA se agregaron controles de suero positivo. suero negativo y diluente.

 RESULTADOS Y DISCUSI�N

 Para el control de la estomatitis vesicular en Venezuela se ven�a utilizando, desde 1973, la vacuna a virus vivo modificado desarrollada por Casta�eda (3) y Casta�eda et al. (4). Pero como el virus de estomatitis es muy l�bil, estas vacunas ten�an que ser aplicadas entre 4 y 6 semanas despu�s de elaboradas. Produc�an una inmunidad de 3 a 4 meses, por lo cual ten�an que ser aplicadas varias veces al a�o. Por eso surgi� la necesidad de desarrollar otra vacuna con un per�odo de expiraci�n m�s largo y m�s efectivo como la que se presenta en este trabajo. 

El Cuadro 1 muestra los t�tulos infecciosos de las cosechas de virus utilizadas en las vacunas elaboradas; tambi�n los resultados obtenidos cuando se estudi� la estabilidad antig�nica de las vacunas mediante la medici�n de los t�tulos antig�nicos de las cosechas por fijaci�n de complemento en el momento de la elaboraci�n de las vacunas, y despu�s de la ruptura de la emulsi�n una vez transcurrido un a�o de conservaci�n a temperatura de refrigeraci�n. 

Los resultados obtenidos demuestran que se pueden vacunar eficiente- mente bovinos con una vacuna inactivada contra la estomatitis vesicular preparada con virus producido en c�lulas BHK₂₁, inactivado con B-propiolactona y adicionada con un adyuvante oleoso como el empleado. En el futuro se utilizar�n dosis de 5 ml de vacunas para mejorar a�n m�s la respuesta.

 La Figura 1 y el Cuadro 2 muestran los t�tulos de anticuerpos fijadores de complemento en los bovinos de los cuatro grupos, durante los primeros tres meses de estudio. Estos datos se utilizaron para la comparaci�n de t�tulos con los obtenidos por ELISA. La Figura 2 y los Cuadros 2, 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados obtenidos cuando se evaluaron los niveles de anticuerpos por ELISA en bovinos tomados al azar de los cuatro grupos en estudio, durante un a�o. 

En todos los animales, la vacuna obtenida produjo una buena respuesta inmune en la primovacunaci�n y en las revacunaciones. No se presentaron reacciones indeseables en los bovinos en los sitios de inoculaci�n de la vacuna.

 Los sueros del resto de los animales vacunados ser�n estudiados posteriormente, ya que esta investigaci�n contin�a.

Los valores obtenidos para los niveles de anticuerpos por el m�todo ELISA, son consistentes y comparables con los obtenidos por fijaci�n de complemento y otros m�todos seg�n Caste�eda et al. (2), Lauerman y Hanson (14) y Lauerman et al. (15), e Indican que vacunas con un contenido viral entre 10^7.6 y 10^8.3 DL50% como las producidas y probadas en este trabajo, son capaces de inducir muy buena inmunidad en bovinos. 

Siguiendo un esquema de vacunaci�n dependiendo de la edad de los animales, se puede pensar que t�tulos mayores de 1:600 corresponden a una s�lida inmunidad en los bovinos, determinados por el m�todo de ELISA, ya que estos equivaldr�an a t�tulos mayores de 1:150, por fijaci�n de complemento. La utilizaci�n de bovinos en condiciones controladas de campo, evaluando la respuesta inmune por el m�todo de ELISA, seg�n el esquema seguido en estos estudios, resulta ser m�s pr�ctico que el de vacunar y luego desafiar bovinos con virus pat�geno en condiciones de laboratorio, el cual es, adem�s, sumamente costoso. De todas manera, a nivel de productores y para control oficial en el laboratorio, las vacunas deben ser probadas primero por un m�todo como el descrito por Lauerman et al. (15), utilizando ratones adultos.

 Agradecimiento

 El autor deja constancia expresa de su agradecimiento a Jos� M. Obreg�n H., Mar�a W. de Ag�ero y Mario R. Blanco por su entusiasta y competente colaboraci�n en la elaboraci�n de este trabajo, sin cuya cooperaci�n no se hubiera podido realizar en el plazo previsto. 

A los doctores Gustavo D'Enjoy y Alberto Pati�o, especial reconocimiento por su magn�fico aporte en las actividades realizadas a nivel de campo.

 A los doctores Pedro Ramos, Jeannette de Castillo, Gladys C. de Blanco, licenciada Cristina de Gonz�lez y la TAI Aura Osorio, gratitud por el oportuno y adecuado suministro de materiales indispensables para esta investigaci�n. 

A Lucila R. de Labrador se le reconoce su excelente trabajo secretarial. 

SUMMARY

A new inactivated vaccine against vesicular stomatitis virus type New Jersey was developed. The virus was produced in BHK₂₁ cells, then inactivated with B-propiolactone and mixed with oil adyuvant. Each 4 ml dose of vaccine contained 10^7.4 to 10^8.2 ID₅₀ of virus. The vaccine was stable for at least one year at  4� to 6�C, when the serological titer of the antigen was determined by complement fixation tests. Immunogenicity of the vaccine was studied in a field trial on four groups of bovines of different ages (total 90 bovines), which were vaccinated and revaccinated at 3,6,8 or 12 months after. Immunity was determined by the evaluation of antibody levels in vaccinated and control animals by ELISA and Complement Fixation tests. The vaccination scheme followed in this study seems to be practical for the control of vesicular stomatitis in enzootic areas.

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