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Veterinaria Tropical. 15: 39-55. 1990 OBTENCIÓN
DE UNA VACUNA INACTIVADA OLEOSA CONTRA EL VIRUS Jesús Castañeda G.* 1
Trabajo realizado como parte del Proyecto S1-2048, financiado por el Consejo
Nacional de |
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RESUMEN Se desarrolló una vacuna inactivada contra el virus New Jersey de estomatitis vesicular, Esta vacuna mostró estabilidad de por lo menos un año, guardada a temperatura de refrigeración. El contenido virar de los lotes de vacuna producidos fue de 107.4 a 108.2DI50% y los títulos antigénicos determinados por fijación de complemento cuando las vacunas fueron elaboradas, y después de un año de almacenamiento, cuando se procedió a la ruptura de la emulsión, indican una muy buena estabilidad antigénica de las mismas. La vacuna fue aplicada en 90 bovinos de diferentes edades mantenidos en condiciones de campo y produjo buena respuesta inmune según se desprende de los altos títulos de anticuerpos, determinados por el método de ELISA indirecto. El esquema de vacunación utilizado para bovinos de diferentes edades parece ser aconsejable para el control de la estomatitis vesicular . INTRODUCCIÓN La estomatitis vesicular es una enfermedad viral que ataca a varias especies de mamíferos domésticos y salvajes, y también al hombre, por lo cual es considerada como una zoonosis. Se encuentra distribuida en todos los países del continente americano desde Perú hasta los Estados Unidos (8, 9) donde causa pérdidas considerables a las ganaderías bovina y porcina (6). Se han realizado esfuerzos para desarrollar vacunas eficaces que permitan el control de esta enfermedad. Entre estas vacunas se encuentran las desarrolladas por Lauerman et al. (11, 12, 13), las cuales fueron elaboradas a partir de virus vivo modificado por pases seriados en embriones de pollo, y luego el virus vacunal era producido en este mismo substrato. Las experiencias de vacunación de ganados con esta vacuna en Wisconsin y Georgia (USA), Panamá, Ecuador y Guatemala fueron revisadas por Lauerman y Hanson (14). Desde 1971 se utilizó en Venezuela una vacuna a base de virus vivo modificado mediante pases seriados en ratones, huevos embrionados y cultivos celulares, la cual fue desarrollada por Castañeda (3) y Castañeda et al. (4). Esta vacuna se presentaba en forma líquida como una suspensión de virus en solución tamponada de fosfatos con 40% de glicerina, para aplicación intramuscular en bovinos, porcinos y equinos, y se aplicó extensivamente hasta mediados de 1990, con una producción anual de 700.000 a 1.000.000 de dosis. Se han producido vacunas a base de virus inactivado, adicionadas de adyuvantes, como las desarrolladas por Correa (7) utilizada a escala experimental en Guatemala. Lauerman et al. (15) informaron sobre el desarrollo de una vacuna inactivada contra estomatitis para ser utilizada en los Estados Unidos, en programas de emergencia por brotes de la enfermedad. Por su parte Yilma et al. (18) informaron sobre la respuesta inmunitaria de bovinos y ratones cuando fueron vacunados con una vacuna elaborada con Glicoproteína G. extraida del virus de estomatitis vesicular tipo New Jersey. En este trabajo se presentan los resultados obtenidos en bovinos con una vacuna inactivada contra estomatitis vesicular, elaborada con virus tipo New Jersey adaptado y producido en cultivo celular, luego inactivado y adicionado de adyuvante oleoso. MATERIALES Y MÉTODOS Virus Después de probar varias cepas de virus tipo New Jersey, se seleccionó una de origen porcino que se adaptó completamente en cultivos de Células BHK21 clon 13, por pases alternos en monocapas y en suspensión, la cual se mantuvo estable en cuanto a la producción de antígenos (cosechas) con títulos infecciosos adecuados. Esta cepa de virus constituye la semilla maestra y se identificó como VEV-NJ-Proyecto S1-2048. De esta semilla se ha producido un limitado número de pases los cuales son utilizados como semilla de producción. La semilla de producción se utilizó para la elaboración de antígeno (cosechas) para las vacunas y también para la producción de stocks de virus, que una vez concentrado y purificado, según el procedimiento descrito McSharry et al. (16), es utilizado para las pruebas de ELISA Indirecto en la evaluación de la respuesta inmune en bovinos vacunados. Producción de antígeno Con la semilla de producción (no más de cinco pases de la semilla maestra) se inocularon frascos rotatorios (rollers), frascos de Roux o cultivos en suspensión de células BHK21 clon 13; se adicionaron de medio de Eagle de mantenimiento y luego se incubaron durante unas 24 horas, hasta la producción de cerca del 100% de efecto citopático. Estos cultivos fueron puestos en congelación, entre -15°C y -20°C, hasta el momento de la inactivación. Antes de la inactivación, los frascos fueron descongelados, después se hizo un pool y se sometió acentrifugación durante 15 minutos, a 3.000rpm. Se recolectó el sobrenadante, del cual fueron enviadas muestras al laboratorio de serología para pruebas de pureza y título serológico por fijación de complemento. También se tomó una muestra para determinar título infeccioso en cultivos celulares o ratones lactantes, y para prueba de esterilidad en los medios bacteriológicos: caldo simple, tioglicolato y sabouraud. Inactivación del antigeno Conocido el resultado satisfactorio de las pruebas de control antes mencionadas, se procedió a la inactivación del antígeno por adición de B-propiolactona para una concentración final de 1/4.000. Veinticuatro horas después de inactivado el virus y mantenido en refrigeración, fueron tomadas muestras para pruebas de inocuidad en aproximada- mente cien ratones ractantes, de 4-6 días, los cuales se inocularon por vía intraperitoneal y fueron observados por siete días. Todo ratón que moría, después de 48 horas de haber sido inoculado, se enviaba aserología para detección de virus. Formulaci6n y elaboración de la vacuna La vacuna fue preparada con un 50% de antígeno inactivado y un 50% de un adyuvante oleoso compuesto por un 89,5% de Marcol 52, un 9,5% de Montanide 888 y un 1% de Tween 80. Para el proceso de mezcla y emulsificación se utilizó un emulsificador JANKE KUNK EL, IKAWERK, ULTRA- TORRAX Modelo SD-45 de TEKMAN COMPANY. Tanto el antígeno corno el adyuvante se mantuvieron a baja temperatura para evitar el calentamiento durante la homogeneización. Control de calidad de la vacuna Para los controles de calidad de la vacuna terminada se siguieron, en general, los procedimientos recomendados por el Centro Panamericano de Fiebre Aftosa -OPS-OMS-BID, para el control de calidad de las vacunas oleosas contra fiebre aftosa:
Al cumplirse este tiempo, a la muestra de cada lote se le rompió la emulsión, y la fase acuosa resultante, correspondiente al antígeno, fue enviada al Laboratorio de Serología para estudios de identidad y título serológico por fijación de complemento. Controles de inmunidad a nivel de campo, por evaluación de anticuerpos circulantes Para estas pruebas se utilizaron noventa bovinos agrupados en cuatro grupos etarios, los cuales recibieron vacunaciones con dosis de 4 ml de vacuna por vía intramuscular en el cuello y observados luego durante un año, con sangrías mensuales. La distribución de estos animales según edades y el cronograma de vacunaciones y sangrías, fue el siguiente:
Los sueros eran procesados y guardados en congelación hasta que se realizaran las evaluaciones de anticuerpos correspondientes por el método de ELISA indirecto (10, 17) o por una prueba directa modificada de fijación de complemento (1) utilizada por microtécnica, en placas plásticas de 96 huecos con fondo en V, para fines de comparación de ambas técnicas, en los sueros obtenidos hasta el tercer mes post-vacunación. Método de ELISA indirecto El procedimiento utilizado para esta prueba fue el siguiente: se tapizaron placas de microtécnica de 96 vasos (LIMBRO- TITERTEK 76-381-04), cada uno con 100 m l de una dilución apropiada de antígeno (previamente titulado en bloque contra el conjugado utilizado y sueros positivos, negativos y diluente) en tampón de carbonato bicarbonato pH 9,6* (*Buffer Carbonato -bicarbonato (buffer de bloqueó) pH 9,6: 1 ,59 g de Na2CO3; 2,938 de NaHCO3; 2,0 g de NaN3 (ácida sódica), completando hasta 1 litro con H2O destilada y guardarla a 4 °C por no más de dos semanas. ); se incubaron durante una hora a temperatura ambiente y luego a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron dos veces con PBS -Tween pH 7 ,4 ** (**PBS -Tween pH 7,4: 8,0 g NaCI; 0,2 g KH PO2; 2,9 g Na2H PO4 -12H2O; 0,2 g Kce; 0,5 ml Tween 20, Completar a un litro con agua destilada. El pH final es de 7,4- guardar a 4°C. ) luego se bloquearon con 100 m l por vaso de PBS -Tween con 1% de gelatina blanca (GB) a temperatura ambiente por una hora. Fue retirada la solución de bloqueo y se colocaron en cada vaso de las muestras de suero problema en las diluciones deseadas (2 vasos por dilución) en PBS -Tween + 1% GB, y se incubó una hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBS -Tween y se agregaron 100 l por vaso de anti IgG bovina conjugada con peroxidasa de rábano picante, óptimamente diluida en PBS -Tween + 1% de GB. Se mantuvo una hora a temperatura ambiente. Luego fue lavada nuevamente con PBS -Tween y se le agregraron 100 m l de substrato de ortofenildiamina (OPD) a cada vaso. Las placas se mantuvieron por cinco a diez minutos a temperatura ambiente y luego fue frenada su reacción con 50 m l H2SO4 1M. La absorbancia se midió en espectrofotómetro Titertek Multiskan a 492 nm. En todos los ensayos de ELISA se agregaron controles de suero positivo. suero negativo y diluente. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para el control de la estomatitis vesicular en Venezuela se venía utilizando, desde 1973, la vacuna a virus vivo modificado desarrollada por Castañeda (3) y Castañeda et al. (4). Pero como el virus de estomatitis es muy lábil, estas vacunas tenían que ser aplicadas entre 4 y 6 semanas después de elaboradas. Producían una inmunidad de 3 a 4 meses, por lo cual tenían que ser aplicadas varias veces al año. Por eso surgió la necesidad de desarrollar otra vacuna con un período de expiración más largo y más efectivo como la que se presenta en este trabajo. El Cuadro 1 muestra los títulos infecciosos de las cosechas de virus utilizadas en las vacunas elaboradas; también los resultados obtenidos cuando se estudió la estabilidad antigénica de las vacunas mediante la medición de los títulos antigénicos de las cosechas por fijación de complemento en el momento de la elaboración de las vacunas, y después de la ruptura de la emulsión una vez transcurrido un año de conservación a temperatura de refrigeración. Los resultados obtenidos demuestran que se pueden vacunar eficiente- mente bovinos con una vacuna inactivada contra la estomatitis vesicular preparada con virus producido en células BHK21, inactivado con B-propiolactona y adicionada con un adyuvante oleoso como el empleado. En el futuro se utilizarán dosis de 5 ml de vacunas para mejorar aún más la respuesta. La Figura 1 y el Cuadro 2 muestran los títulos de anticuerpos fijadores de complemento en los bovinos de los cuatro grupos, durante los primeros tres meses de estudio. Estos datos se utilizaron para la comparación de títulos con los obtenidos por ELISA. La Figura 2 y los Cuadros 2, 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados obtenidos cuando se evaluaron los niveles de anticuerpos por ELISA en bovinos tomados al azar de los cuatro grupos en estudio, durante un año. En todos los animales, la vacuna obtenida produjo una buena respuesta inmune en la primovacunación y en las revacunaciones. No se presentaron reacciones indeseables en los bovinos en los sitios de inoculación de la vacuna. Los sueros del resto de los animales vacunados serán estudiados posteriormente, ya que esta investigación continúa.
Los valores obtenidos para los niveles de anticuerpos por el método ELISA, son consistentes y comparables con los obtenidos por fijación de complemento y otros métodos según Casteñeda et al. (2), Lauerman y Hanson (14) y Lauerman et al. (15), e Indican que vacunas con un contenido viral entre 107.6 y 108.3 DL50% como las producidas y probadas en este trabajo, son capaces de inducir muy buena inmunidad en bovinos. Siguiendo un esquema de vacunación dependiendo de la edad de los animales, se puede pensar que títulos mayores de 1:600 corresponden a una sólida inmunidad en los bovinos, determinados por el método de ELISA, ya que estos equivaldrían a títulos mayores de 1:150, por fijación de complemento. La utilización de bovinos en condiciones controladas de campo, evaluando la respuesta inmune por el método de ELISA, según el esquema seguido en estos estudios, resulta ser más práctico que el de vacunar y luego desafiar bovinos con virus patógeno en condiciones de laboratorio, el cual es, además, sumamente costoso. De todas manera, a nivel de productores y para control oficial en el laboratorio, las vacunas deben ser probadas primero por un método como el descrito por Lauerman et al. (15), utilizando ratones adultos. Agradecimiento El autor deja constancia expresa de su agradecimiento a José M. Obregón H., María W. de Agüero y Mario R. Blanco por su entusiasta y competente colaboración en la elaboración de este trabajo, sin cuya cooperación no se hubiera podido realizar en el plazo previsto. A los doctores Gustavo D'Enjoy y Alberto Patiño, especial reconocimiento por su magnífico aporte en las actividades realizadas a nivel de campo. A los doctores Pedro Ramos, Jeannette de Castillo, Gladys C. de Blanco, licenciada Cristina de González y la TAI Aura Osorio, gratitud por el oportuno y adecuado suministro de materiales indispensables para esta investigación. A Lucila R. de Labrador se le reconoce su excelente trabajo secretarial. SUMMARY A new inactivated vaccine against vesicular stomatitis virus type New Jersey was developed. The virus was produced in BHK21 cells, then inactivated with B-propiolactone and mixed with oil adyuvant. Each 4 ml dose of vaccine contained 107.4 to 108.2 ID50 of virus. The vaccine was stable for at least one year at 4° to 6°C, when the serological titer of the antigen was determined by complement fixation tests. Immunogenicity of the vaccine was studied in a field trial on four groups of bovines of different ages (total 90 bovines), which were vaccinated and revaccinated at 3,6,8 or 12 months after. Immunity was determined by the evaluation of antibody levels in vaccinated and control animals by ELISA and Complement Fixation tests. The vaccination scheme followed in this study seems to be practical for the control of vesicular stomatitis in enzootic areas. BIBLIOGRAFÍA 1. BOULANGER, P. and G. I. SANNISTER. A modified direct complement fixation test for the detection of antibodies in the serum of cattle previously infected with vesicular stomatitis virus. J. Immunol. 85: 368-374. 1960. 2. CASTAÑEDA, J., L. H. LAUERMAN and R. P. HANSON. Evaluation of virus neutralization tests and association of indices to cattle to the virus of vesicular stomatitis New Jersey. Am. J. Vet. Res. Vol. 27 119: 963-969. 1964. 3. CASTAÑEDA, J. Obtención de una vacuna contra la estomatitis vesicular. Trabajo de Ascenso. Maracay, Ven., Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Central de Venezuela. 1969. 4. CASTAÑEDA, J., G. GÓMEZ, J. M. JIMÉNEZ, A. MALDONADO y J. SALESTRINI. 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