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Veterinaria Tropical, 7: 45-57. 1982 ESTUDIO DE LA
ELIMINACIÓN DE FACTORES DE
RESISTENCIA y ENTEROTOXINAS Aura Gallardo de López* y Salomón Kadis**
**College of Veterinary Medicine Recibido: Enero 27, 1983 |
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RESUMEN Nueve cepas de Escherichia coli de origen bovino y porcino fueron tratadas con mitomicina C, hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja para eliminar su resistencia a los agentes antimicrobianos y su enterotoxigenicidad. Mitomicina C logró la eliminación de algunos factores de resistencia en 2 de 5 cepas de origen bovino. Un efecto similar fue obtenido en 2 de 4 cepas de origen porcino cuando fueron tratadas con hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja. Los agentes químicos utilizados en este estudio no provocaron la pérdida de los determinantes responsables de la producción de enterotoxinas en las cepas bovinas y porcinas. INTRODUCCIÓN Los determinantes gen éticos de la resistencia a los agentes antimicrobianos y la producción de enterotoxinas en Escherichia coli se ha demostrado que pertenecen a elementos extracromosonales o plasmidos (1,5,6,7,12,15) .La pérdida de estos determinantes puede ocurrir en forma espontánea durante la división celular o por un defecto en el proceso de replicación. Sin embargo, la pérdida de los plasmidos que controlan la resistencia a los antimicrobianos (factores R) y la producción de enterotoxinas (Ent) puede ser incrementada por exposición a agentes químicos y físicos denominados mutágenos. Entre los agentes químicos figuran el hidrobromuro de fenantridina, (ethidium bromide) , urea, mitomicina C y los colorantes de acridina como la acriflavina y acridina naranja. Los primeros intentos de eliminación de plásmidos fueron realizados por WATANABE y FUKASAWA (16) , quienes lograron eliminar la resistencia múltiple en E. coli y Shigella spp mediante la utilización de acridina naranja. La eliminación de la resistencia frente a algunos agentes antimicrobianos también ha sido referida en E. coli, Salmonella oranienburg, S. derby, S. panama y Shigella flexneri por BOUANCHAUD y col. (2) cuando dichas cepas fueron tratadas con hidrobromuro de fenantridina. Otros autores han señalado la eliminación de diferentes propiedades en E. coli tales como el factor sexual (F+) , fermentación de la lactosa (Lact+) , hemolisinas (Hly+) , antígeno K88 (K88+) y enterotoxina (Ent+) (8,10,11). El propósito del presente trabajo fue el de intentar la eliminación de factores R y enterotoxigenicidad en cepas de E. coli de origen suino y bovino, con el uso de mitomicina C, hidrobromuro de fenantridina y naranja de acridina como mutágenos. MATERIALES Y MÉTODOS Bacterias: Nueve cepas enterotoxigénicas de E. coli se incluyeron en este estudio. Las cepas de origen bovino fueron las siguientes: 665, resistente a ampicilina (Ap), cefalotin (Ce), doxiciclina (Dx) , novobiocina (Nv) , tetraciclina (Tc) , estreptomicina (Sm) y sulfametoxipiridiazina (Su) J 694, resistente a Ap, Ce, Dx, kanamicina (Kn) , neomicina (Nm) , Nv, Tc, Sm y Su; 1394 resistente a Ap, Kn, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su; B 14 resistente a Ap, Ce, cloranfenicol (Cm) , Dx, Nv, Tc, Sm y Su y 505, resistente a Ap, Ce, Cm, Dx, Nv, Tc, Sm, y Su. Estas cepas fueron suministradas por el Centro Nacional de Enfermedades Animales (NADC) , Ames, Iowa-USA. Las cepas de origen suino fueron las que a continuación se describen: 3197, resistente a Ap, Ce, Dx, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su; 263, resistente a Dx, Nm, Nv, Sm y Tc; 4942, resistente a Dx, Nm, Nv, Tc, y Su y 5032, resisten- te a Ce, Dx, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su. Estas cepas fueron obtenidas en el Departamento de Micro- biología, Universidad de Georgia, USA. La cepa de E. coli K12, mutante 2, fue utilizada como receptora en los experimentos de transferencia de la resistencia y obtenida del Centro de Enfermedades (CDC) , Atlanta, Georgia, USA. Agentes Químicos: Fueron empleados los agentes químicos mitomicina C (Sigma Chemical Company) , hidrobromuro de fanantridina (Hidrobromuro de 3,8-día-mino 5-etil-6-fenilfenantridina) (Ethidium bromide, Sigma Chemical Company) y acridina naranja (Sigma Chemical Company) . Transferencia de la resistencia a los antimicrobianos: La determinación de la transferencia de la resistencia en las cepas de origen bovino fue realizada siguiendo una metodología ya descrita (9) .En trabajo previo publicado por el autor se estudió la transferencia en las cepas de origen suino utilizadas en el presente estudio (9) .La cepa de E. Coli KI2, mutante 2, se utilizó como receptora en estos experimentos de transferencia. Eliminación de la resistencia a los antimicrobianos y enterotoxinas: Este proceso fue iniciado por la aplicación de mitocina C, hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja siguiendo el procedimiento descrito por MILLER (10) , excepto que se utilizó caldo nutritivo (Difco Laboratories), pH 7,6. Las cepas a ser tratadas fueron cultivadas en diferentes concentraciones de cada mutágeno. Estas concentraciones fueron las siguientes: mitomicina C, 0,31 a lO mcg/ml; hidrobromuro de fenantridina 10-160 mcg/ml y acridina naranja 10-80 mcg/ml. La más alta concentración del mutágeno que permitió desarrollo bacteriano se transfirió a agar-MacConkey (Difco Laboratories). A fin de detectar la eliminación de la resistencia, se realizaron transferencias simultáneas de colonias individuales obtenidas en el medio anterior a diferentes agares de MacConkey adicionadas con antimicrobianos. Esto indica, por ejemplo, que la cepa 665 resistente a Ap, Ce, Dx, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su, fue transferida después del tratamiento con mutágenos a agar MacConkey y de este a diferentes medios de MacConkey adicionados Con ampicilina, cefalotin, doxiciclina, neomicina tetraciclina, estreptomicina y sulfametoxipiridiazinal la falta de desarrollo bacteriano en algunos de estos medios indicó que la cepa perdió su resistencia al antibiótico adicionado y por lo tanto la efectividad del mutágeno. Las Concentraciones de loS antimicrobianos en el medio de MacConkey fueron las siguientes: ampicilina 10 mcg/ml, cefalotin 30 mcg/ml, doxiciclina 30 mcg/ml, kanamicina 30 mcg/ml, neomicina 30 mcg/ml, novobiocina 30 mcg/ml, tetraciclina 30 rncg/ml, estreptomicina 35 mcg/ml y sulfametoxipiridiazina 100 mcg/ml. Veinte colonias de cada una de las cepas tratadas fueron examinadas para determinar si el mutágeno era efectivo en la eliminación de la enterotoxigenicidad. La toxina termoestable fue detectada por la técnica de ratón lactante (4) y las asas intestinales ligadas en cerdo (13). Las pruebas para la toxina term01ábil fueron realizadas en conejos lactantes siguiendo la técnica descrita por BURGESS y col. (3) , excepto que las cepas que fueron cultivadas en caldo soya tripticasa adicionando con 0,6% de extracto de levadura. RESULTADOS Las cepas multiresistentes y enterotoxigénicas de origen bovino transfirieron su resistencia a la cepa receptora Kl2 de E. coli. lo que confirma la naturaleza extracromosal de la resistencia referida. El tratamiento con mitomicina C eliminó la resistencia a doxiciclina, tetraciclina y estreptomicina en la ce- pa 665 ya la ampicilina, doxiciclina, kanamicina y tetraciclina en la 694 (Cuadro 1). Los tratamientos efectuados con hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja en las concentraciones de 160 y 80 mcg/ml, respectivamente, no provocaron eliminación de la resistencia en ninguna de las cepas bovinas. Dos de las cuatro cepas de origen suino perdieron parcialmente su resistencia a los antimicrobianos cuando fueron tratadas con hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja (Cuadros 2 y 3) . La mitomicina fue inefectiva en la eliminación de la resistencia a la concentración de 2,5 mcg/ml en las cepas de origen suino. En las condiciones en las que se realizó este estudio los mutágenos utilizados no lograron eliminar los plasmidos que controlan la producción en enterotoxinas en cepas de E. coli de origen bovino y suino. DISCUSIÓN El intento de eliminación de factores de resistencia reveló que el tratamiento con mitomicina C convirtió a 2 cepas de origen bovino en cepas sensibles a algunos antimicrobianos, a los cuales inicialmente estas cepas fueron resistentes. En dos cepas de origen porcino se logró un efecto semejante debido a la acción del hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja. Ha sido señalado que la resistencia a los antimicrobianos puede ser eliminada por colorantes de acridina, hidrobromuro de fenantridina y mitomicina, lo que confirma la naturaleza extracromosal de los genes que controlan la resistencia (2,16) . Intentos de eliminación del plásmido que controla la producción de enterotoxinas han sido logrados transitoriamente (11,14). La eliminación parcial de la resistencia a los antimicrobianos y la falla en la eliminación del plásmido Ent, señalados en el presente estudio, pueden explicarse como sigue:
El número de colonias estudiadas en este experimento no fue lo suficientemente elevado como para asegurar que el tratamiento con los mutágenos estudiados no fue efectivo en la eliminación de la propiedad de producir enterotoxinas.
SUMMARY Elimination of plasmid-borne determinants for drug resistance and enterotoxin production was attempted in 9 Escherichia coli strains. It was found that mitomycin C eliminated some antibiotic resistance in 2 of 5 bovine strains. Curing of drug resistance was obtained in 2 of 4 porcine strains with ethidiun bromide and acridine orange treatments. None of the agents under test eliminated the determinants for enterotoxin production in the bovine or porcine strains. BIBLIOGRAFÍA 1.- ADEN, D., N. REED, N. UNDERDAHL and C. MEBUS. Transferable drug resistance among Enterobacteriaceae from cases of neonatal diarrhea in calves and piglets. Appl. Microbiol.. 18: 961-964. 1969. 2.- BOUANCHAUD, D. , M. R. SEAVIZZI and Y. CHABBERT. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in Enterobacteria and Staphylococci. J. Gen. Micro- bio1. 54: 417-425. 1969. 3.- BURGESS, M. N. , C. M. COWLEY, J. MELLING., N. A. MULLAN and P.NEWSOME. Assay of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in infant rabbits. J. Med. Microbil. 12: 291-302. 1979. 4.- DEAN, A. G. , Y. CHING., R. WILLIAM and R. HAIDEN. Test for Escherichia coli enterooxin using infant mice: application in a study of diarrhea in children in Honolulu. J. Infext. Dis. 125: 407-411. 1972. 5.- ELWELL, L. P. Plasmid-mediated factors associated with viru1ence of bacteria to animals. Ann. Rev. Microbiol. 34: 465-496. 1980. 6.- GYLES, C. L., M. SO and S. FALKOW. The enterotoxin plasmids of Escherichia coli. J. Infect. Dis. 130: 40-49. 1974. 7.- HUBER, W., D. KARICA, T. NEAL, P. SCHAURRENBERGER and R. MARTIN. Antibiotic sensitivity patterns and R-factors in domestic anima1s. Arch. Environ. Healt. 22: 561-567. 1971. 8.- IKEDA, Y., T. IIJIMA and K. TAJIMA. Elimination of F -episome from a male strains of Escherichia coli by treatment with Sarkomycin and related antibiotic. J. Gen Appl. Microbiol. Tokyo 13: 247-251. 1983. 9.- LOPEZ, A. G. de, S. KADIS and E. SHOTTS. Transfer of drug resistance and enterotoxin production in porcine Escherichia coli strains Am. J. Vet. Res. 43: 499-501. 1982. 10.- MILLER, J. H. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Srping-Harbor. N. Y. 1972 p. 104-106. 11.- MITCHELL, L. de G. and R. KENWORTHY. Attempted elimination of plamids-determined haemolysin, K88 antigen and enterotoxin from Escherichia coli pathogenic for pigs. J. App. Bacteriol. 42: 207-212. 1977. 12.- OCHIAI, K., T. YAMANAHA, J. KIMURA an O. SAWADA. Studies of intheritance of drug resistance in bacteria. Bacteriol. Review. 27: 87-115. 1959. 13.- SMITH. H. W. and S. HALL. Observations by the ligated intestinal segment and oral inoculations in pi9s, calves, lams and rabbits. J. Pathot. Bacteriol 93: 499-529. 1967. 14.- SMITH, H. and M. LINGOOD. Observations on the pathogenesis properties of K88, Hl and Ent plasmids of Escherichia coli with particular reference to porcine strains. J. Med. Microbiol 4: 467-488..1971 15.- WATANABE, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriol. Rev. 27: 87-115. 1963. 16.________. and T. FUKASABA. Episome-mediated transfer of drug resistance in Enterobacteriaceae. II. Elimination of resistance factors with acridine dyes. J. Bacterio1 81: 679-683. 1961. |
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