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Veterinaria Tropical, 7: 45-57. 1982 ESTUDIO DE LA
ELIMINACI�N DE FACTORES DE
RESISTENCIA y ENTEROTOXINAS Aura Gallardo de L�pez* y Salom�n Kadis**
**College of Veterinary Medicine Recibido: Enero 27, 1983 |
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RESUMEN Nueve cepas de Escherichia coli de origen bovino y porcino fueron tratadas con mitomicina C, hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja para eliminar su resistencia a los agentes antimicrobianos y su enterotoxigenicidad. Mitomicina C logr� la eliminaci�n de algunos factores de resistencia en 2 de 5 cepas de origen bovino. Un efecto similar fue obtenido en 2 de 4 cepas de origen porcino cuando fueron tratadas con hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja. Los agentes qu�micos utilizados en este estudio no provocaron la p�rdida de los determinantes responsables de la producci�n de enterotoxinas en las cepas bovinas y porcinas. INTRODUCCI�N Los determinantes gen �ticos de la resistencia a los agentes antimicrobianos y la producci�n de enterotoxinas en Escherichia coli se ha demostrado que pertenecen a elementos extracromosonales o plasmidos (1,5,6,7,12,15) .La p�rdida de estos determinantes puede ocurrir en forma espont�nea durante la divisi�n celular o por un defecto en el proceso de replicaci�n. Sin embargo, la p�rdida de los plasmidos que controlan la resistencia a los antimicrobianos (factores R) y la producci�n de enterotoxinas (Ent) puede ser incrementada por exposici�n a agentes qu�micos y f�sicos denominados mut�genos. Entre los agentes qu�micos figuran el hidrobromuro de fenantridina, (ethidium bromide) , urea, mitomicina C y los colorantes de acridina como la acriflavina y acridina naranja. Los primeros intentos de eliminaci�n de pl�smidos fueron realizados por WATANABE y FUKASAWA (16) , quienes lograron eliminar la resistencia m�ltiple en E. coli y Shigella spp mediante la utilizaci�n de acridina naranja. La eliminaci�n de la resistencia frente a algunos agentes antimicrobianos tambi�n ha sido referida en E. coli, Salmonella oranienburg, S. derby, S. panama y Shigella flexneri por BOUANCHAUD y col. (2) cuando dichas cepas fueron tratadas con hidrobromuro de fenantridina. Otros autores han se�alado la eliminaci�n de diferentes propiedades en E. coli tales como el factor sexual (F+) , fermentaci�n de la lactosa (Lact+) , hemolisinas (Hly+) , ant�geno K88 (K88+) y enterotoxina (Ent+) (8,10,11). El prop�sito del presente trabajo fue el de intentar la eliminaci�n de factores R y enterotoxigenicidad en cepas de E. coli de origen suino y bovino, con el uso de mitomicina C, hidrobromuro de fenantridina y naranja de acridina como mut�genos. MATERIALES Y M�TODOS Bacterias: Nueve cepas enterotoxig�nicas de E. coli se incluyeron en este estudio. Las cepas de origen bovino fueron las siguientes: 665, resistente a ampicilina (Ap), cefalotin (Ce), doxiciclina (Dx) , novobiocina (Nv) , tetraciclina (Tc) , estreptomicina (Sm) y sulfametoxipiridiazina (Su) J 694, resistente a Ap, Ce, Dx, kanamicina (Kn) , neomicina (Nm) , Nv, Tc, Sm y Su; 1394 resistente a Ap, Kn, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su; B 14 resistente a Ap, Ce, cloranfenicol (Cm) , Dx, Nv, Tc, Sm y Su y 505, resistente a Ap, Ce, Cm, Dx, Nv, Tc, Sm, y Su. Estas cepas fueron suministradas por el Centro Nacional de Enfermedades Animales (NADC) , Ames, Iowa-USA. Las cepas de origen suino fueron las que a continuaci�n se describen: 3197, resistente a Ap, Ce, Dx, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su; 263, resistente a Dx, Nm, Nv, Sm y Tc; 4942, resistente a Dx, Nm, Nv, Tc, y Su y 5032, resisten- te a Ce, Dx, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su. Estas cepas fueron obtenidas en el Departamento de Micro- biolog�a, Universidad de Georgia, USA. La cepa de E. coli K12, mutante 2, fue utilizada como receptora en los experimentos de transferencia de la resistencia y obtenida del Centro de Enfermedades (CDC) , Atlanta, Georgia, USA. Agentes Qu�micos: Fueron empleados los agentes qu�micos mitomicina C (Sigma Chemical Company) , hidrobromuro de fanantridina (Hidrobromuro de 3,8-d�a-mino 5-etil-6-fenilfenantridina) (Ethidium bromide, Sigma Chemical Company) y acridina naranja (Sigma Chemical Company) . Transferencia de la resistencia a los antimicrobianos: La determinaci�n de la transferencia de la resistencia en las cepas de origen bovino fue realizada siguiendo una metodolog�a ya descrita (9) .En trabajo previo publicado por el autor se estudi� la transferencia en las cepas de origen suino utilizadas en el presente estudio (9) .La cepa de E. Coli KI2, mutante 2, se utiliz� como receptora en estos experimentos de transferencia. Eliminaci�n de la resistencia a los antimicrobianos y enterotoxinas: Este proceso fue iniciado por la aplicaci�n de mitocina C, hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja siguiendo el procedimiento descrito por MILLER (10) , excepto que se utiliz� caldo nutritivo (Difco Laboratories), pH 7,6. Las cepas a ser tratadas fueron cultivadas en diferentes concentraciones de cada mut�geno. Estas concentraciones fueron las siguientes: mitomicina C, 0,31 a lO mcg/ml; hidrobromuro de fenantridina 10-160 mcg/ml y acridina naranja 10-80 mcg/ml. La m�s alta concentraci�n del mut�geno que permiti� desarrollo bacteriano se transfiri� a agar-MacConkey (Difco Laboratories). A fin de detectar la eliminaci�n de la resistencia, se realizaron transferencias simult�neas de colonias individuales obtenidas en el medio anterior a diferentes agares de MacConkey adicionadas con antimicrobianos. Esto indica, por ejemplo, que la cepa 665 resistente a Ap, Ce, Dx, Nm, Nv, Tc, Sm, y Su, fue transferida despu�s del tratamiento con mut�genos a agar MacConkey y de este a diferentes medios de MacConkey adicionados Con ampicilina, cefalotin, doxiciclina, neomicina tetraciclina, estreptomicina y sulfametoxipiridiazinal la falta de desarrollo bacteriano en algunos de estos medios indic� que la cepa perdi� su resistencia al antibi�tico adicionado y por lo tanto la efectividad del mut�geno. Las Concentraciones de loS antimicrobianos en el medio de MacConkey fueron las siguientes: ampicilina 10 mcg/ml, cefalotin 30 mcg/ml, doxiciclina 30 mcg/ml, kanamicina 30 mcg/ml, neomicina 30 mcg/ml, novobiocina 30 mcg/ml, tetraciclina 30 rncg/ml, estreptomicina 35 mcg/ml y sulfametoxipiridiazina 100 mcg/ml. Veinte colonias de cada una de las cepas tratadas fueron examinadas para determinar si el mut�geno era efectivo en la eliminaci�n de la enterotoxigenicidad. La toxina termoestable fue detectada por la t�cnica de rat�n lactante (4) y las asas intestinales ligadas en cerdo (13). Las pruebas para la toxina term01�bil fueron realizadas en conejos lactantes siguiendo la t�cnica descrita por BURGESS y col. (3) , excepto que las cepas que fueron cultivadas en caldo soya tripticasa adicionando con 0,6% de extracto de levadura. RESULTADOS Las cepas multiresistentes y enterotoxig�nicas de origen bovino transfirieron su resistencia a la cepa receptora Kl2 de E. coli. lo que confirma la naturaleza extracromosal de la resistencia referida. El tratamiento con mitomicina C elimin� la resistencia a doxiciclina, tetraciclina y estreptomicina en la ce- pa 665 ya la ampicilina, doxiciclina, kanamicina y tetraciclina en la 694 (Cuadro 1). Los tratamientos efectuados con hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja en las concentraciones de 160 y 80 mcg/ml, respectivamente, no provocaron eliminaci�n de la resistencia en ninguna de las cepas bovinas. Dos de las cuatro cepas de origen suino perdieron parcialmente su resistencia a los antimicrobianos cuando fueron tratadas con hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja (Cuadros 2 y 3) . La mitomicina fue inefectiva en la eliminaci�n de la resistencia a la concentraci�n de 2,5 mcg/ml en las cepas de origen suino. En las condiciones en las que se realiz� este estudio los mut�genos utilizados no lograron eliminar los plasmidos que controlan la producci�n en enterotoxinas en cepas de E. coli de origen bovino y suino. DISCUSI�N El intento de eliminaci�n de factores de resistencia revel� que el tratamiento con mitomicina C convirti� a 2 cepas de origen bovino en cepas sensibles a algunos antimicrobianos, a los cuales inicialmente estas cepas fueron resistentes. En dos cepas de origen porcino se logr� un efecto semejante debido a la acci�n del hidrobromuro de fenantridina y acridina naranja. Ha sido se�alado que la resistencia a los antimicrobianos puede ser eliminada por colorantes de acridina, hidrobromuro de fenantridina y mitomicina, lo que confirma la naturaleza extracromosal de los genes que controlan la resistencia (2,16) . Intentos de eliminaci�n del pl�smido que controla la producci�n de enterotoxinas han sido logrados transitoriamente (11,14). La eliminaci�n parcial de la resistencia a los antimicrobianos y la falla en la eliminaci�n del pl�smido Ent, se�alados en el presente estudio, pueden explicarse como sigue:
El n�mero de colonias estudiadas en este experimento no fue lo suficientemente elevado como para asegurar que el tratamiento con los mut�genos estudiados no fue efectivo en la eliminaci�n de la propiedad de producir enterotoxinas.
SUMMARY Elimination of plasmid-borne determinants for drug resistance and enterotoxin production was attempted in 9 Escherichia coli strains. It was found that mitomycin C eliminated some antibiotic resistance in 2 of 5 bovine strains. Curing of drug resistance was obtained in 2 of 4 porcine strains with ethidiun bromide and acridine orange treatments. None of the agents under test eliminated the determinants for enterotoxin production in the bovine or porcine strains. BIBLIOGRAF�A 1.- ADEN, D., N. REED, N. UNDERDAHL and C. MEBUS. Transferable drug resistance among Enterobacteriaceae from cases of neonatal diarrhea in calves and piglets. Appl. Microbiol.. 18: 961-964. 1969. 2.- BOUANCHAUD, D. , M. R. SEAVIZZI and Y. CHABBERT. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in Enterobacteria and Staphylococci. J. Gen. Micro- bio1. 54: 417-425. 1969. 3.- BURGESS, M. N. , C. M. COWLEY, J. MELLING., N. A. MULLAN and P.NEWSOME. Assay of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in infant rabbits. J. Med. Microbil. 12: 291-302. 1979. 4.- DEAN, A. G. , Y. CHING., R. WILLIAM and R. HAIDEN. Test for Escherichia coli enterooxin using infant mice: application in a study of diarrhea in children in Honolulu. J. Infext. Dis. 125: 407-411. 1972. 5.- ELWELL, L. P. Plasmid-mediated factors associated with viru1ence of bacteria to animals. Ann. Rev. Microbiol. 34: 465-496. 1980. 6.- GYLES, C. L., M. SO and S. FALKOW. The enterotoxin plasmids of Escherichia coli. J. Infect. Dis. 130: 40-49. 1974. 7.- HUBER, W., D. KARICA, T. NEAL, P. SCHAURRENBERGER and R. MARTIN. Antibiotic sensitivity patterns and R-factors in domestic anima1s. Arch. Environ. Healt. 22: 561-567. 1971. 8.- IKEDA, Y., T. IIJIMA and K. TAJIMA. Elimination of F -episome from a male strains of Escherichia coli by treatment with Sarkomycin and related antibiotic. J. Gen Appl. Microbiol. Tokyo 13: 247-251. 1983. 9.- LOPEZ, A. G. de, S. KADIS and E. SHOTTS. Transfer of drug resistance and enterotoxin production in porcine Escherichia coli strains Am. J. Vet. Res. 43: 499-501. 1982. 10.- MILLER, J. H. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Srping-Harbor. N. Y. 1972 p. 104-106. 11.- MITCHELL, L. de G. and R. KENWORTHY. Attempted elimination of plamids-determined haemolysin, K88 antigen and enterotoxin from Escherichia coli pathogenic for pigs. J. App. Bacteriol. 42: 207-212. 1977. 12.- OCHIAI, K., T. YAMANAHA, J. KIMURA an O. SAWADA. Studies of intheritance of drug resistance in bacteria. Bacteriol. Review. 27: 87-115. 1959. 13.- SMITH. H. W. and S. HALL. Observations by the ligated intestinal segment and oral inoculations in pi9s, calves, lams and rabbits. J. Pathot. Bacteriol 93: 499-529. 1967. 14.- SMITH, H. and M. LINGOOD. Observations on the pathogenesis properties of K88, Hl and Ent plasmids of Escherichia coli with particular reference to porcine strains. J. Med. Microbiol 4: 467-488..1971 15.- WATANABE, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriol. Rev. 27: 87-115. 1963. 16.________. and T. FUKASABA. Episome-mediated transfer of drug resistance in Enterobacteriaceae. II. Elimination of resistance factors with acridine dyes. J. Bacterio1 81: 679-683. 1961. |
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